Tiangen带你走入miRNA的世界[选购宝典]

microRNA这种非编码的单链RNA分子广泛存在于植物、线虫及人类的细胞中，发挥着重要作用。如何研究miRNA的功能呢？研究人员已经摸索出一套方法。但是，如果没有好的产品协助，miRNA的研究道路恐怕会走得很艰辛。现在，就让天根公司的一些miRNA产品带你走入miRNA的世界。

十几年前，microRNA（miRNA）还俨然一个不起眼的小分子，无人关注。然而近几年，它已经配角变主角，成为研究人员竞相研究的对象。这种非编码的单链RNA分子广泛存在于植物、线虫及人类的细胞中，发挥着重要作用。别看它小，只有~22个核苷酸，但控制着包括细胞增殖、凋亡、器官发生、发育、造血以及肿瘤发生等若干途径。

miRNA不仅影响或者调控了细胞增殖、分化过程中的mRNA和关键蛋白质，还可能同时具有肿瘤抑制因子和原癌基因的功能，在癌症的诊断和治疗中发挥重要的作用。最新的研究还表明，miRNA可在细胞间游走，介导细胞间和组织器官间的信息传递。此外，miRNA对多种植物激素的调控对于植物体的发育也具有重要意义。

如何研究miRNA的功能呢？一般来说，研究人员收集发育或分化的不同阶段的样品，或者疾病及正常组织的样品，从中提取出miRNA。然后利用miRNA特异的芯片绘制出细胞和组织的miRNA表达谱，找出表达差异的miRNA。通过生物信息学分析，研究人员通常会挑出几个候选的miRNA，开展进一步的分析，如荧光定量PCR验证。当然，基因表达分析所常用的过表达和沉默，也是一种有力的方法来研究miRNA的功能。

miRNA的研究看起来并不复杂，但是因为miRNA很小，也就让每一步都充满了挑战。首先便是miRNA的提取，以往传统的RNA提取试剂盒都是为回收mRNA而设计的，往往会弃去较小的RNA分子以提高mRNA产率，这样一来主角miRNA反而不见了。因此，我们必须采用专门的miRNA提取试剂盒。

不少进口品牌早就推出了miRNA提取试剂盒，但大多价格不菲，让miRNA研究人员直呼吃不消。大家都希望有一些国际品质国产价格的试剂盒，如今天根公司真的推出了。想当年，天根公司质优价廉的核酸纯化试剂盒真正让国内的实验室摆脱了酚氯仿，走进了kit纯化的新时代。

天根（Tiangen）公司这一款miRcute miRNA提取分离试剂盒就是专门为miRNA的提取而开发的。试剂盒中的吸附柱采用了特殊的硅基质膜填料，大大增强了对RNA的吸附能力，尤其是200 nt以下的小RNA。高效的裂解液能够轻松地裂解各种样本，包括细胞、动物组织、植物组织、血清、血浆等。提取过程也很简单，样品裂解后用氯仿抽提，然后洗涤几次，一小时内就能轻松完成。除了miRNA，此试剂盒还能得到siRNA、snRNA等小片段RNA，将操作步骤略微修改，还能进行总RNA的提取，真是用途多多。至于提取效果如何，有图1为证。

图1. 血浆中提取miRNA后，通过KR201+FP401检测miR-16和miR-24的电泳图。Marker为50 bp Marker；1-3为血浆中miR-24；4-6为血清中miR-24；7-9为血浆中miR-16；10-12为血清中miR-16。

除了提取，miRNA的定量也是个难题。miRNA长度很短，仅有21-23个核苷酸，并且没有mRNA 3’端的poly(A)尾巴，因此无法采用普通的反转录和荧光定量PCR来检测miRNA。目前，miRNA的反转录主要采用两种方法，一种是茎环反转录法（见图2），另一种是加尾反转录法（见图3）。

茎环反转录法利用可以正确折叠为茎环结构的引物对miRNA进行反转录，以获得人为加长后的miRNA cDNA第一链，然后利用合适的退火温度将反转录引物的茎环结构打开并与PCR扩增的正反向引物结合，再通过染料法或探针法进行荧光定量PCR检测。此种方法的特异性较高，但是对引物的要求也很高，需要引物在反转录阶段形成茎环式的正确构型，因此设计起来较为繁琐和困难。采用这种方法的研究人员一般会选择购买经过验证的商品化茎环反转录引物，但毕竟选择范围有限，如果你的研究对象不是人、小鼠或大鼠，估计很难买到，而且对财力的要求也很高啊。

加尾反转录法则是利用poly(A)聚合酶为成熟的miRNA加上poly(A)尾巴，然后用5’端带通用标签的Oligo-dT作为反转录引物，获得人为加长的miRNA cDNA第一链，最后用与通用标签序列互补的反向引物进行染料法的荧光定量PCR检测。这种方法可以批量地将所有成熟miRNA加上poly(A)尾巴，然后进行反转录和检测，无需繁琐的引物设计，因此被很多实验室采用。

天根的miRcute miRNA cDNA 第一链合成试剂盒正是采用加尾反转录法对成熟miRNA进行反转录，最终生成miRNA对应的cDNA第一链。该试剂盒可采用总RNA或miRNA作为模板，使用最新一代的PolyA聚合酶和第三代反转录酶Quant Reverse Transcriptase进行加尾和反转录，具有高效的Poly(A)修饰和逆转录效率，可从20 pg-2 μg的总RNA中有效制备miRNA 对应的cDNA第一链。而且，反转录反应后，产物中不存在抑制后续实验的成分。试剂盒中包含了miRNA加尾和逆转录过程所需的所有试剂，使用起来非常方便。

对于转录之后的定量，天根也提供了一个配套的试剂盒—miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒。此试剂盒采用SYBR® Green I嵌合荧光法的原理进行miRNA 荧光定量检测。试剂盒内包含了定量所需的2×miRcute miRNA premix以及与miRcute miRNA cDNA 第一链合成试剂盒（KR201）配合使用的Reverse primer。

2×miRcute miRNA premix（含SYBR，含ROX）是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，采用抗体修饰的热启动DNA polymerase和特制的缓冲液体系，使检测反应特异性更好，灵敏度更高，可检测pg级总RNA中miRNA的单碱基差异，且在模板大浓度梯度范围具有优秀的线性关系（图4）。

如果你近期正准备开展miRNA研究，那我还有个好消息要告诉你。Tiangen在11月推出了miRNA荧光定量PCR检测的“黄金套装”和“白金套装”，相当优惠，并加赠miRNA实验中的“圣经”——《miRNA实验指南》，绝对不容错过。如果你想要了解更多信息，请浏览http://www.ebiotrade.com/custom/tiangen/101026/index.htm。（生物通 余亮）