活细胞表面受体二聚化/寡聚化分析[创新技巧]

【字体: 时间:2010年11月24日 来源:IBA公司

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  目前有两个不同的方向进行受体二聚化/寡聚化检测,一个是体外检测,一个是活细胞检测。CO-IP是应用最广泛的检测二聚化/寡聚化的体外方法。活细胞检测的方法主要基于能量共振转移原理,包括FRET、pbFRET 、BRET、HTRF(TR-FRET)等。Tag-lite将SNAP-Tag、HaloTag和HTRF技术结合起来,可以非常方便可靠地检测活细胞受体二聚化/寡聚化。

G蛋白偶联受体很久以来一直被认为是以单体的形式存在,并且与配体结合进行信号转导的。然而,近年来,越来越多的实验证据表明,有的GPCR可形成同源二聚体或异源二聚体而发挥作用。虽然这种聚集在与G蛋白结合方面的作用还存在争议,但是许多GPCR确实可形成二聚体/寡聚体是毋庸置疑的,尤其是C类受体(class C receptor)。二聚体/寡聚体除了可能参与G蛋白结合,还可能在GPCR脱敏、GPCR合成后从内质网分泌到细胞表面等过程中发挥作用。

二聚化/寡聚化的发现给新药研发提供了新的思路,尤其是对于异源聚集。在这种模式下,药物可能与一个GPCR结合,并共同活化了第二个GPCR,引起细胞反应。如果我们只用其中一个GPCR去做筛选,很可能看不到有意义的结果。同时,受体聚集的提出,给孤儿受体(orphan GPCR)也提出了新的解释。或许,这些孤儿受体可与其它GPCR形成二聚体/寡聚体,作为parter,而不是以单体的形式发挥作用。

有两个不同的方向进行受体二聚化/寡聚化检测,一个是体外检测,一个是活细胞检测。CO-IP是应用最广泛的检测二聚化/寡聚化的体外方法。活细胞检测的方法主要基于能量共振转移(RET)原理,包括FRET、pbFRET 、BRET、HTRF(TR-FRET)等。Tag-lite将SNAP-Tag、HaloTag和HTRF技术结合起来,可以非常方便可靠地检测活细胞受体二聚化/寡聚化。

检测原理

同源二聚体的检测
构建SNAP和GPCR的共表达载体,转染入细胞,可表达SNAP-GPCR的融合蛋白。然后,加入分别标记了Tb和Acceptor荧光染料的底物,则部分GPCR标记了Tb(Tb-GPCR),部分标记了Acceptor荧光染料(Acceotor-GPCR)。如果GPCR可以形成同源二聚体,配体刺激后,两个GPCR会相互靠近并偶联。Tb-GPCR与Acceptor-GPCR之间发生能量共振转移,检测到HTRF信号,见图1。

图1:GPCR同源二聚体检测模式

异源二聚体的检测
分别构建SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的表达载体,共转染,可得到表达SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的细胞。加入标记了Tb的SNAP底物和标记了Acceptor荧光染料的CLIP底物,细胞表面的受体为Tb-SNAP-GPCR1和Acceptor-CLIP-GPCR2。如果GPCR形成异源二聚体,配体刺激后,GPCR1/2相互靠近发挥作用。Tb与Acceptor之间发生能量共振转移,检测到HTRF信号,见图2。

图2:GPCR异源二聚体检测模式

HaloTag与SNAP相似,也是一个自身标记的酶,通过与标记了荧光的底物反应,将自身标记上荧光。在这个实验中,我们也可以构建HaloTag与GPCR的表达载体。

检测特点和优势
• 活细胞水平的检测
• 检测背景低:时间分辨荧光的检测方式,没有荧光染料自身的交叉干扰和来自样品自发荧光的干扰
• 实验结果可靠:FRET技术使检测结果反映的是真正的受体聚集,而不是仅仅相互靠近
• 不需要抗体:Tag-lite利用最新的SNAP技术,不需要抗体来确定实验的特异性

应用领域
• 受体二聚化/寡聚化分析
• 孤儿受体的研究

应用实例

C类GPCR:GPCRGABAB1与GABAB2的异源二聚化检测
分别构建GABAB1与SNAP-Tag和GABAB2与HaloTag的表达载体,共转染细胞。蛋白表达后,固定SNAP的底物BG-Tb浓度不变,配制不同浓度的HaloTag的底物Halo-Red浓度,将两种底物混合后加入细胞。孵育1h后,检测HTRF信号,实验结果如图3所示。

GABAB1与GABAB2形成异源二聚体发挥作用。随着Halo-Red浓度的加大,有更多的能量从Tb转移到Red染料上,HTRF信号增强,直到达到平衡。

 

图3:GABAB1与GABAB2的异源二聚化检测

A类GPCR:多巴胺D2与Delta 阿片的异源二聚化检测
分别构建Delta阿片与SNAP-Tag和多巴胺与HaloTag的表达载体,共转染细胞。蛋白表达后,固定SNAP的底物BG-Tb浓度不变,配制不同浓度的HaloTag的底物Halo-Red浓度,将两种底物混合后加入细胞。孵育1h后,检测HTRF信号,实验结果如图4所示。

  

图4:GABAB1与GABAB2的异源二聚化检测

多巴胺D2与Delta阿片形成异源二聚体发挥作用。随着Halo-Red浓度的加大,有更多的能量从Tb转移到Red染料上,HTRF信号增强,直到达到平衡。

Cisbio可提供的产品
• 含有SNAP的质粒
• 含有CLIP的质粒
• 含有HaloTag的质粒
• 标记了Tb的底物
• 标记了Acceptor荧光素的底物,荧光素可以发绿光或者红光
• 标记缓冲液

联系方式
孙翠巍
Cuiwei.Sun@iba-group.com
周时勇 Shiyong.Zhou@iba-group.com
周  寅 Yin.Zhou@iba-group.com

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