活细胞表面受体配体结合分析[创新技巧]

进行受体配体结合检测有同位素方法和非同位素方法。非同位素方法包括时间分辨荧光（TRF）和荧光偏振（FP）等方法，操作简单，对环境无污染，是受体配体结合检测的发展方向。Cisbio的Tag-lite技术将新出现的SNAP-Tag技术和经典的HTRF技术结合起来，稳定可靠，是同位素方法的替代解决方案。

G蛋白偶联受体与配体结合后，受体构象发生改变，7个跨膜区域的相对位置发生改变，将信号传递到胞内，影响细胞功能。受体配体结合是GPCR发挥功能的第一步。

进行受体配体结合检测有同位素方法和非同位素方法。基于滤膜的同位素方法是经典方法，但是它需要洗涤，操作复杂，对环境污染大，越来越多的人在寻求不需要洗涤的更安全的方法。闪烁亲近检测（SPA）是不需要洗涤的同位素方法，它操作简单一些，但是非常昂贵，并且还是基于同位素的检测平台。非同位素方法包括时间分辨荧光（TRF）和荧光偏振（FP）等方法，操作简单，对环境无污染，是受体配体结合检测的发展方向。

所有的实验方法都需要受体和标记配体，并且实验设计相似。在很多情况下，需要使用多种方法来满足下面的实验需求：
• 非特异结合低
• 在标记配体的Kd值范围，特异性结合率 > 80%
• 对于竞争性实验，标记配体的浓度 ≤ Kd
• 加入的标记配体的结合率 < 10%
• 没有受体存在的情况下，标记配体不产生浓度反应
• 实验能达到平衡，信号稳定
• 可重复性高
• 合适及稳定的检测窗口，例如Z’ > 0.5

Cisbio的Tag-lite技术将新出现的SNAP-Tag技术和经典的HTRF技术结合起来，稳定可靠，是同位素方法的替代解决方案。

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检测原理
SNAP/CLIP底物与HTRF荧光染料反应形成衍生物，例如与铽穴状化合物（Lumi4®-Tb）形成衍生物，SANP-GPCR或CLIP-GPCR融合蛋白与其反应，形成标记了Tb的GPCR。然后，加入荧光染料标记的配体，Tb与配体上的荧光染料产生能量共振转移，根据信号强弱来检测受体配体结合程度。

实验过程

构建含有标签融合蛋白的Tag-lite 质粒
将pSNAP或pCLIP质粒与目标GPCR的基因序列构建质粒。转染入细胞后，该质粒可表达N端融合了SNAP或CLIP的GPCR，如图1。

图1：构建SNAP-GPCR表达载体

用Tag-lite染料标记GPCR
SNAP和CLIP底物可与HTRF的供体（Donor）Tb穴状化合物结合。底物与SNAP或CLIP反应后，HTRF的供体就与GPCR连接在一起。底物也可与HTRF的荧光受体结合（Acceptor）,形成标记了受体的GPCR，用于其它应用。过程如图2所示。

图2：细胞标记形成GPCR-SNAP-Tb

        加入细胞                      与Tb-底物衍生物孵育                    GPCR-SNAP-Tb形成

受体配体结合
连接了HTRF供体的GPCR与荧光素标记的配体结合（该荧光素是HTRF的受体），产生HTRF信号，即：两个特异性发射光谱，如图3 所示。

图3：受体配体结合实验

   GPCR-SNAP-Tb细胞             加入配体               受体配体结合检测

整个过程如图4所示:

图4：Tag-lite受体配体结合实验过程

GPCR-SNAP质粒   GPCR+SNAP融合蛋白   标记了Tb的GPCR        GPCR与配体结合，产生HTRF信号                                                                

实验材料：
• pSNAP-GPCR质粒: 用来瞬时表达GPCR-SNAP或构建稳转细胞。质粒对GPCR功能没有影响，可在细胞中进行功能性检测。
• Tag-lite SNAP-Lumi4-Tb底物：将HTRF Tb穴状化合物标记到GPCR上。
• Tag-lite 荧光标记配体: 经过验证的与GPCR结合的特异性配体，其上标记HTRF受体染料（红色或绿色）。

应用实例
多巴胺D2受体配体结合实验

进行了配体Kd值检测和受体配体竞争抑制实验，结果如图5、图6所示。

图5：多巴胺D2受体配体Kd测量实验

构建SNAP与多巴胺D2受体的表达载体，瞬时转染后，加入Tb标记的底物，得到GPCR- SNAP-Tb。Tag-lite。然后，加入浓度逐渐升高的红色荧光素标记的配体，检测HTRF信号。本实验所得Kd = 15 ± 8 nM。

图6：多巴胺D2受体配体竞争抑制实验

SNAP-多巴胺D2瞬时转染细胞后，标记Tb。然后，加入3 nM红色荧光素标记的配体和NAPS/PPHT。测定的IC50分别为：0.3 nM和16 nM。

Tag-lite与同位素方法的比较

GPCR家族	受体	化 合 物	同位素方法 （Ki nM）	Tag-lite （Ki nM）
多巴胺	D2	NAPS（拮抗剂）	0.64	0.14
		PPHT（激动剂）	13.3	7.65

Cisbio可提供的产品
• 含有SNAP的质粒：提供含有信号肽的空质粒和转染了受体基因的质粒
• 含有CLIP的质粒：提供含有信号肽的空质粒和转染了受体基因的质粒
• 标记了Tb的底物
• 标记了Acceptor荧光素的配体，荧光素可以发绿光或者红光
• 标记缓冲液

荧光素标记的配体列表如下：

产品货号	标 记 的 配 体	GPCR家族	受体
L0001RED	Vasopressin receptors red antagonist #2 - 5,000 tests	Vasopressin	V2
L0002RED	Dopamine D2 receptor red antagonist - 5,000 tests	Dopamine	D2
L0003RED	Vasopressin receptors red antagonist - 5,000 tests	Vasopressin	V1a
L0004RED	VPAC1 receptor red agonist - 5,000 tests	Vasoactive Intestinal Peptide VPAC1	VPAC1
L0005RED	Opioid receptors red antagonist - 5,000 tests	Opioid	Delta, Kappa, Mu
L0006RED	Melanocortin receptors red agonist - 5,000 tests	Melanocortin	M3C, MC4, MC5
L0007RED	Angiotensin receptors red agonist - 5,000 tests	Angiotensin	AT1,AT2
L0008RED	NK1 receptor red agonist - 5,000 tests	Tachykinin	NK1
L0009RED	NK2 receptor red agonist - 5000 tests	Tachykinin	NK2
L0010RED	Alpha adrenergic receptor red antagonist - 5,000 tests	Adrenergic	Alpha1A, Alpha 1B
L0011GRE	Beta2 adrenergic receptor green antago - 5000 tests	Adrenergic	Beta2
L0012RED	CXCR4 receptor red agonist - 5,000 tests	Chemokine	CXCR4
L0013RED	CCK receptors red agonist - 5,000 tests	Cholecystokinin	CCK1,CCK2
L0014RED	GABAB receptor red antagonist - 5,000 tests	GABA	B
L0015GRE	Histamine H1 receptor green inv ago -5,000 tests	Histamine	H1
L0016RED	Bradykinin B1 receptor red antagonist - 5,000 tests	Bradykinin	B1
L0017RED	Bradykinin B2 receptor red antagonist - 5,000 tests	Bradykinin	B2
L0018RED	GIP receptor red agonist - 5,000 tests	Glucagon	GIP
L0019RED	Bombesin receptors red agonist - 5,000 tests	Bombesin	BB2
L0020RED	Ghrelin 1A receptor red agonist - 5,000 tests	Ghrelin	GHSR1A
L0022RED	Endothelin receptors red agonist - 5,000 tests	Endothelin	ETA, ETB
L0024RED	Chemokine CCL3 receptors red agonist - 5,000 tests	Chemokine	CCR1
L0025RED	Orexin receptors red agonist - 5,000 tests	Orexin	OX1, OX2
L0026RED	UTR2 receptor red agonist - 5,000 tests	Urotensin	UTR2
L0027RED	PRRP receptor red agonist - 5,000 tests	Prolactin-releasing peptide PRRP	PRRP
L0028RED	NMU1 receptor red agonist - 5,000 tests	Neuromedin	U1
L0030RED	GLP1  receptor red agonist - 5,000 tests	Glucagon	GLP1
L0038RED	Bombesin receptors red agonist #2 - 5,000 tests	Bombesin	BB1, BB3

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