蛋白质组学技术与肿瘤研究

　　蛋白质组学（proteomics）的概念是由澳大利亚科学家Marc Wilkins和Keith Williams于1994年提出的，它是指一个细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。由于同一时间特定的细胞、组织或有机体中并非所有的蛋白质都表达，故蛋白质组具有高度动态性及细胞特异性，一个有机体的不同细胞能够表达出它的全部蛋白的不同阶段。蛋白质组的动态性和细胞类特异性不仅对传统分析提出了挑战，同时也为人类常见多发疾病——肿瘤发生、发展机制的阐明和肿瘤的早期诊断、治疗带来了新的希望，现对此作一简要的介绍。

蛋白质组学技术

    蛋白质组学技术主要包括蛋白质分离、鉴定技术和蛋白质相互作用分析。

    1．蛋白质分离技术：目前蛋白质的分离通常采用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2D-PAGE）、亲和层析、毛细管等电聚焦、毛细管区带电泳和反相高效液相色谱等。其中核心技术是2D-PAGE，它是迄今为止最为广泛使用的研究蛋白质丰度和翻译后修饰的方法。其基本原理是先将蛋白质变性后，使用固定Ph梯度（immobilized pH gradient, IPG）凝胶，根据蛋白质电荷差异分离出不同pI值的蛋白质带，再将此胶条置于含SDS的聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋白质分子量而加以分离。目前，一般通过此法可以分离得到1000～3000个蛋白质样品，最多时可以分离得到11000个蛋白质样点，分辨率可达到ng级。新近出现的差异凝胶电泳（differntial  gel electrophoresis,DIGE）是2D-PAGE的一大革新，DIGE可选用不同的荧光染料在同一块2D凝胶内标记不同蛋白质，为更好地分离蛋白质提供了条件。

    2.蛋白质的鉴定：目前主要的鉴定技术包括质谱（mass spectrometry，MS）分析、Edman法、高效液相色谱法（high performance liquid chromatograph，HPLC）、氨基酸序列分析法等，其核心技术是质谱分析。质谱分析的原理是使样品离子化后，根据不同离子间的质荷比（m/z）的差异来分离，再通过测定肽段离子相关参数如飞行时间（time of flying, TOF）确定相对分子量。质谱技术应用于组织的蛋白质分析鉴定，可以比较正常与疾病组织蛋白质表达。若将冰冻组织制成切片，并用基质辅助激光解析电离（matrixassisted laser desorption/ionization, MALDI）分析这一系列的连续空间切片，既避免因个别物质跨组织结构而造成的空间分布不连续性，又可比较正常和病变组织的蛋白质组表达的差异，所得结果还能通过专用软件搜索数据库而鉴定蛋白质，此类蛋白质的定性测定。若通过稳定同位素标记，则可以用质谱进行蛋白质的定量分析。此外，质谱技术还用于鉴定蛋白质复合物组成、确定蛋白质翻译后修饰的类型与发生位点等。

    3．蛋白质相互作用分析：常用的蛋白质相互作用分析方法用酵母双杂交（yeast two-hybrid，Y2Z）、亲和层析、免疫沉淀、蛋白质交联等。其中，Y2Z是最重要的一种方法，它的基本原理是利用真核转录因子的DNA结合功能域（DNA binding domain，BD）和转录激活功能域（activation domain, AD）独立存在无转录活性，而接近该功能域则会激活转录的特性，将酵母的转录因子BD和AD分解，使编码BD和AD的DNA片段与需要研究的两种蛋白的cDNA分别构建重组体，最后根据两个重组体在同一酵母细胞中产生的融合蛋白的相互作用以判断所研究的蛋白之间是否存在相互作用。因为如果两种蛋白能相互作用，则BD和AD被拉近，转录活性被激活；反之，则转录活性不激活。由于Y2Z在细胞内检测蛋白质的相互作用，无需分离纯化蛋白质，已成为大规模高通量分析的主要技术。应用Y2Z可以分析已知蛋白质之间是否存在相互作用，确定发生相互作用所必需的功能域，也可以从已知蛋白质出发，探索与该蛋白质存在的相互作用的未知蛋白质。分析蛋白质之间的相互作用及其方式，认识与特定生理活动相关的蛋白质网络，绘制出蛋白质相互作用的图谱（interaction mapping）。研究蛋白质之间的相互作用不仅是功能蛋白质组学的重要内容，也为实现蛋白质组的模拟与预测奠定了坚实的基础，更为从整体上全面探讨肿瘤等疾病发生的调控机制提供了有力的工具。

蛋白质组学相关技术在肿瘤研究中的应用

    由于蛋白质是作为生物体生命活动的执行者和体现者，所以从整体角度、全景式地研究不同时期、不同条件下细胞内发生的蛋白质变化具有重要的理论和应用价值，这正是蛋白质组学研究的意义。肿瘤是一种由环境和遗传因素相互作用的多基因、多蛋白质参与的常见多发病。随着人类社会的老龄化、工业化程度的加剧和人类生活环境质量的恶化，肿瘤的发生率日益上升，对人类的危害也在不断升级中。所以阐明肿瘤的发生机制和早诊断早治疗已经成为不容缓的课题。利用蛋白质组学技术可以从整体上全面地、动态地、定量地分析比较正常与癌变标本中蛋白质种类和数量的改变，这不仅有助于阐明肿瘤发病机制，还能筛选鉴定出肿瘤蛋白质特异性标记和特异性抗原，应用于肿瘤的早期诊断、早期治疗，此外对肿瘤的新药研制也有重要的指导意义。

     1．阐明肿瘤的发病机制：肿瘤的发生涉及癌基因的激活、原癌基因的失活、凋亡抑制等多基因变化，是多种基因和蛋白质相互作用的结果。蛋白质组学技术可为探索肿瘤发病机制提供有力的工具。

    俞利荣等通过人BEL-7404肝癌细胞系、L-02正常肝细胞系的蛋白质组双向凝胶电泳图谱分析，发现BEL-7404肝癌细胞系中内质网钙结合蛋白（reticulocalbin）、GSTP1-1（glutathione-s-transferaseP）等7种蛋白表达上调，而B-1微管蛋白下调。高表达的蛋白具有抵抗肿瘤药物、抑制凋亡、促进增殖的作用。而在L-02细胞系中，具有肿瘤抑制作用的serpin和maspin precursor表达增高，尤其是表面脂肪酸结合蛋白（epidermal fatty acid-binding protein, EFABP）和A-FABP（FABP，adipocyte-type）只见于正常肝细胞中，这些分子在睾丸、卵巢、膀胱等生殖系肿瘤和乳腺癌、直肠结合肠癌中有着类似的变化。作者认为这些蛋白分子在肿瘤演进和维持正常细胞生长方面起重要作用。
Jungblut等报道，钙粒蛋白B（calgranulin B）在直肠肿瘤组织中特异表达，其中87%患者表现为表达上调；而正常组织、非典型增生的息肉则几乎不表达。提示钙粒蛋白B在一定程度上提高了直肠肿瘤的发生发展，这一研究为阐明直肠肿瘤的机制提供了重要的线索。

    2．筛选、鉴定肿瘤特异性标记和特异性抗原：肿瘤的高危性主要在于早期诊断的困难。就目前研究结果而言，大多数肿瘤均缺乏肿瘤特异性的标志物，或目前临床使用的肿瘤标志物过于单一，且特异性低，敏感性差。寻找更敏感、更具特异性的肿瘤标志物成为目前工作的当务之急。2002年初美国国家肿瘤研究所（National Cancer Institutes, NCI）联合美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration, FDA）首期投资数百万美元，开始了组织蛋白质组学启动计划（tissue proteomics initiative），其目的就是寻找特异的肿瘤标志物。目前，2D-PAGE和MS方法的联合使用是筛选肿瘤特异性标志物的较为理想的方法，在此基础上通过搜索相关的蛋白质组数据库，即可能鉴定出肿瘤的特异性标志物。

    Celis A等结合免疫组织化学的技术对膀胱鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma,SCC）进行了比较蛋白质组学研究，鉴定了一系列区分SCC与移行细胞癌（transitional cell carcinoma, TCC）的特异性蛋白质分子标记。其中，银屑素（psoriasin）是一种钙结合蛋白，由鳞状细胞表达，仅出现在SCC患者的组织及尿液中，在TCC中难以检测。因此，目前把psoriasin作为SCC患者的随访标记。
Lin JD等对比人正常甲状腺组织和四株甲状腺癌组织系，用2D-PAGE分析结果发现：出现在转移性甲状腺胶质癌细胞系（CGTHW-1、高分化甲状腺胶质癌细胞系RO82W-1中的特异蛋白质可作为胶质癌的肿瘤标志物。

     前列腺癌是西方国家最常见的恶性肿瘤，近年在我国的发病率也明显上升。血清前列腺特异性抗原（prostatic specific antigen, PSA）一直是前列腺癌早期诊断的肿瘤标志物，但其检出率低，且常出现假阴性和假阳性。Watkins等利用蛋白质芯片仪作了进一步的研究，检测了35例结肠癌患者血清（其中8例为PSA阴性），发现了一个分子量50.8×103的蛋白质，而正常对照组这个蛋白质均表现为阴性。如果临床经过大量实例可验证这一发现，前列腺癌便可新增加一种简便、有效的肿瘤标志物。

    3．在肿瘤治疗和药物开发中的应用：通过蛋白质组学技术提供有效的药物靶蛋白，这是迄今为止肿瘤药物筛选研究中最新、最有力的手段。从2001年开始，美国和西欧的大型制药企业和生物公司为了寻找药物靶蛋白，皆已投入巨资开发蛋白质组技术。目前已知的药物靶蛋白的数目是400个左右，利用蛋白质组学技术比较研究正常的和癌变的细胞、组织后可发现某些蛋白质出现特异性表达或表达异常，借此，有望在近年将药物靶蛋白的数目扩大至10000个左右。

    通过采用2D-PAGE技术比较用药前后蛋白表达谱变化，可分析药物疗效和毒性信号物质，从而对药物做出评价。Poirier F等运用此法比较AZC（5′-azycytidine）作用Burkitt淋巴瘤的蛋白表达谱，发现用药后细胞增殖能力减弱，而抑癌基因p16表达增加，且有较多蛋白质的表达变化，而这些研究结果有助于对AZC治疗Burkitt淋巴瘤的直接和间接作用及代谢调节通路有一个全面的认识。

问题与展望

    蛋白质组学技术在近几年发展迅速，已经成为后基因组时代研究的热点和主流。1986年世界上第一个蛋白质序列数据库——SWISS-PROT建立至今，大量的人类正常组织和病理组织数据库纷纷建立，随着蛋白质信息学的迅速发展，蛋白质组学技术已经发生质的飞跃。

    但是蛋白质组学技术还远未完善，在肿瘤研究方面，就存在着肿瘤组织中细胞种类繁多、难以获取单一的肿瘤细胞、制备纯化的肿瘤细胞蛋白质困难、肿瘤发生发展中的低丰度蛋白难以分辨等问题。此外，Celis等还发现，即使经过短暂的体外培养，肿瘤细胞的关键蛋白也会发现明显变化。这些问题都为肿瘤蛋白质组学的研究提出了新的挑战。

    随着新技术的不断产生，如激光捕获微切割（laser capture microdissection, LCM）技术，可从多种细胞混合的肿瘤组织中获胜所需的特定的肿瘤细胞，避免蛋白质的异源性。此外，蛋白质芯片、虚拟细胞模型（virtual cell model, E-cell）、2D-DIGE的使用，ICAT（isotope coded affinity tags）技术的完善等都为蛋白质组学技术的完善提供了条件，使蛋白质组最终能成为人类肿瘤机制阐明和防治的最有力的武器之一。