2010年值得关注的技术:锌指核酸酶[创新技巧]

【字体: 时间:2010年12月30日 来源:生物通

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  锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)是人工改造的限制酶,由锌指结构的DNA结合结构域和DNA切割结构域融合而成。它们能够识别并结合指定的位点,高效且精确地切断靶DNA。随后细胞利用天然的DNA修复过程——“同源定向修复”或“非同源末端连接”来治愈靶的断裂。

人们一直很期待定向的基因组改造工具。然而,传统的基因组靶向修饰方法,如同源重组和逆转录病毒法,不仅效率低,特异性也不高。锌指核酸酶技术的出现,给基因组靶向修饰技术带来了希望。

锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)是人工改造的限制酶,由锌指结构的DNA结合结构域和DNA切割结构域融合而成。它们能够识别并结合指定的位点,高效且精确地切断靶DNA。随后细胞利用天然的DNA修复过程——“同源定向修复”或“非同源末端连接”来治愈靶的断裂。这样,研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑,包括基因修复、基因删除和定向的基因添加。

锌指核酸酶已在几种不同系统内成功靶定了基因组:小鼠和人类细胞、斑马鱼、植物、果蝇和大鼠。ZFN曾在人类细胞中成功删除了高达15 Mb的序列,并干扰了人类多能干细胞中的基因。毫无疑问,这些工具的应用将越来越广。

如果您还对锌指核酸酶的技术路线和操作流程不甚了解,那么可参考今年8月发布在《Cold Spring Harbor Protocols》上的一篇免费文章。文中,韩国首尔大学化学系的Jin-Soo Kim等介绍了锌指核酸酶诱导的定向染色体删除,详细地描述了在细胞内检测染色体删除的方法,并利用PCR估计删除的频率。

基于ZFN的巨大潜力,很多团队纷纷开发出改造ZFN的平台。Sangamo Biosciences就是其中之一。2007年,Sigma-Aldrich与Sangamo Biosciences建立了独家合作伙伴关系,通过其CompoZr品牌的产品线和服务来向全球推广ZFN技术。去年,研究人员利用CompoZr锌指核酸酶技术,成功培育出首只靶基因敲除大鼠。最重要的是,使用ZFN技术突变的大鼠后代同样带有基因突变,这证明该修饰是永久可遗传的。

然而,由于CompoZr锌指核酸酶定制服务的价格不菲,很多研究人员也在自己开发ZFN。美国马萨诸塞州总医院的研究人员曾采用Oligomerized Pool Engineering(OPEN)技术选择性地针对不同DNA序列,建立了66个锌指库。从库中筛选的37个ZFN,在检验烟草Sura基因和人类3个基因VEGF2A、HOXB13、CFTR时可达到1%~50%的靶向替换效率。

最近,他们又开发出一种开放的平台,操作简单,成功率高。这种名为CoDA(context-dependent assembly)的平台只是利用标准的克隆技术或定制DNA合成来改造ZFN。利用这种方法,他们快速改变了斑马鱼、拟南芥中的20个基因,总的成功率为50%左右,与OPEN法相当。

除了科研应用,锌指核酸酶技术还有望应用于临床,对人体细胞进行靶向修饰,纠正某些遗传缺陷,这将为许多现阶段无法治愈的疾病提供一个强大的治疗工具。在美国宾州大学,Carl June博士及其同事正使用这项技术来扰乱病人T细胞中的基因,然后将这些细胞植回体内。此临床试验的目的是了解治疗后的细胞是否能重塑病人的免疫系统,并战胜病毒。

年初,爱荷华州立大学的研究人员还以锌指核酸酶作为一种新颖的治疗策略,来靶定HBV病毒的DNA,从而治疗乙型肝炎。研究结果表明,16个克隆中的13个包含移码突变,导致病毒核心蛋白截短。这些结果都预示着ZFN在临床治疗上大有希望。(生物通 薄荷)

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