寻找肿瘤蛋白标记物:从小入手和膜蛋白的问题[创新技巧]

【字体: 时间:2010年02月03日 来源:生物通

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  从上世纪30年代来,癌症的死亡率没有得到很大的改观。科学家们希望能通过从复杂的生物样本中分离鉴定出敏感特异的肿瘤特有的标记,来帮助肿瘤诊断,评估预后,评估肿瘤的分期,复发,药物靶位点等。

生物通报道:从上世纪30年代来,癌症的死亡率没有得到很大的改观。科学家们希望能通过从复杂的生物样本中分离鉴定出敏感特异的肿瘤特有的标记,来帮助肿瘤诊断,评估预后,评估肿瘤的分期,复发,药物靶位点等。

来自阿拉巴马大学伯明翰分校临床蛋白质组学主任James Mobley希望能利用血清,血浆和尿液,寻找胰腺癌的液体,或者蛋白标记物。但是一开始,他就陷入了“Catch-22”(美国谚语,从《第22条军规》延伸而来,是指互相抵触之规律或条件所造成的无法脱身的困窘)——为了能得到深入实验的经费,他们需要首先获得一份前导实验数据。然而当研究人员试图识别胰腺癌蛋白标记物的时候,摆在他们面前的是大量的不确定性,他们需要选择是从哪一种体液和组织中分析蛋白标记物,还需要从低通量,中通量,还是高通量平台中选择一种。

为了解决这些问题,研究人员首先开始查找文献,了解已经出版的有关血液和尿液样品实验数据,他们发现大多数之前的研究都是利用小型的合并样品,结合低通量实验平台,比如2D胶,来识别和检测蛋白。

Mobley博士说,“这些数据表明,研究人员并不是十分肯定”,利用低通量实验方法发现在患者和健康对照组之间存在蛋白差异,但是这些差异在尿液中并没有发现。“因此我们认为,如果我们利用(高通量实验方法)分析血浆,血清和尿液样品,也许我们能找到一些胰腺炎和癌症之间的差别标记物。”

这一研究思路告诉我们,当我们的经费比较少的时候,低成本技术也能获得一些结果,并且精确的了解到,实验还需要怎样进行下去。最终,我们能获得完整的数据,正如Mobley博士所说的那样,“很多情况下,你也许不能制造一个全新的车轮,但是当情况已经发生了,至少你还能制造出一个更好的车轮。”

肿瘤标记物首先是通过利用从肿瘤细胞中提取的单克隆抗体发现的。在获得抗血清后,通过免疫吸附去掉正常细胞,留下肿瘤特异性的抗原,筛选并评估这些候选物成为了寻找新的肿瘤标记物的经典方法。但是筛选并评估候选物的方法费时又耗力,而且当实验室的经费又不足的时候,如何获得进一步的研究进展,以及获得更多的科研经费,是许多实验室都头疼的事情,上述的这一研究提供了一个很好的范例,指出了在这种情况下,研究人员应该采取的实验策略,也就是说实际上,各实验室的研究人员在进行实验的第一步的时候,就要综合考虑好各方面的因素,包括实验经费,遇到的困难,以及如果不成功如何处理等。

肿瘤蛋白标记物又不同于一般的肿瘤标记物,因为蛋白又不能像DNA那样扩增,而且蛋白种类繁多(包括许多同形异构体),因此要找出癌症病患和健康对照之间的明显分子差异并不一件容易的事情,而且像是一些特殊蛋白也颇为令人头疼,比如之前说的低丰度蛋白(见寻找肿瘤蛋白标记物:低丰度蛋白)。

还有一种,就是膜蛋白,膜蛋白是一种重要的生物功能行使“器具”,承担着各种生物功能,在疾病的发生、发展过程中扮演重要角色。已知的许多针对人类疾病研发的药物的靶标是膜蛋白或膜关联蛋白而成功的药物设计很大程度上依赖于人们对膜蛋白的结构与功能数据的正确把握。

而且膜蛋白的蛋白质组学分析是被大家看好的辨识新的药物靶标和/或疾病的生物学标记的好方法,因此如果在寻找肿瘤蛋白标记物的过程中遇到膜蛋白,那如何处理呢?

来自瑞士联邦技术学院苏黎世药品科学协会(Institute of Pharmaceutical Sciences, Zurich, Switzerland)的Christoph Roesli博士就遇到这一问题:他在研究癌症抗体治疗方法的时候,需要识别膜蛋白肿瘤标记物。

膜蛋白常常难以识别,即使多年的蛋白质组学研究支撑技术的显著进步,也没能解决膜蛋白的抽提和增溶困难的问题。同时膜蛋白的识别还需要考虑到一些跨膜蛋白通过许多疏水氨基酸残基锚定在膜结构里面,难以溶解在水性缓冲液系统中,因此识别完整的膜蛋白尤为困难。另外膜蛋白的含量也低,而且更为重要的是,膜蛋白上有一些化学修饰,比如半胱氨酸之间形成的氢键,以及一些糖基化修饰,这些修饰能通过将蛋白包裹来增加蛋白酶消化的难度,从而增加膜蛋白识别的困难。

为了解决这一问题,Roesli博士历时多年,终于发展出了一种能捕捉目的蛋白的方法,这种方法利用生物素标记活体小鼠的整个血液系统,修饰上皮细胞,和靠近血管的的蛋白。在收集和清洗出目标组织之后,研究人员再利用Streptavidin Sepharose柱来捕获蛋白。

并且研究人员为了更进一步增加生物素的亲和反应,通过一个两步实验,分别破坏了半胱氨酸键作用和去除了N端糖链,具体而言是,结合三(2-羰基乙基)磷盐酸盐和N-ethylmaleimide的作用,使得半胱氨酸键断裂,再利用PNGase F去除N端糖链,获得更好的效果。

这样Roesli博士等人利用人类肾癌部分图像就能识别出只存在于肿瘤组织边缘的一组蛋白,以及其它跨膜蛋白,这是解释为什么这些肿瘤能在手术切除的位点频繁复发的一个重要分子线索,“(肿瘤)微环境并不正常”,Roesli博士解释道,“这是癌症入侵的一个肥沃土壤。”

目前生物素亲和反应的试剂盒很多,但是Roesli博士表示,“几乎所有我交谈过的研究人员都认为这个方面不好处理”,所以如果你希望能利用这个技术进行肿瘤蛋白标记物的识别,最后耐心在实验室里进行实验条件的优化。

后记:

到今天为止,肿瘤蛋白标记物系列文章已经完结(另外两篇见生物通),寻找肿瘤蛋白标记物并不是件容易的事,首先我们需要筛选标记物,并且即使幸运的找到了肿瘤标记物候选因子,也还需要从更多病患中筛选和验证最佳的标记物,这个过程也许需要一个漫长,经年累月的积累。上述文章中的科学家们在解决各种遇到的问题的时候,展开思路,奇思妙想,确实给我们许多的启示,比如在去除酶的方面,David Wong博士的想法其实很简单,但是却行而有效,虽然这种技术手段可能还不是很成熟,但是这些点点滴滴的进步为技术的飞跃铺垫了量的积累。

(生物通:张迪)

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