PAXgene系统——组织形态与分子分析的完美结合[新品推荐]

【字体: 时间:2010年04月16日 来源:生物通

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  对于众多与人类或动物组织打交道的实验室来说,他们面临的挑战是如何将有限的样品用在多个分析之中。保留组织形态的常用方法是甲醛固定,接着石蜡包埋。虽然这种方法对组织形态学来说是OK的,但不适合生物分子的提取。因为含有甲醛的固定剂会使生物分子形成交联。其它的稳定剂如RNAlater虽保留了组织中的核酸,却不能保留组织形态。鱼和熊掌,怎可兼得?

对于众多与人类或动物组织打交道的实验室来说,他们面临的挑战是如何将有限的样品用在多个分析之中。保留组织形态的常用方法是甲醛固定,接着石蜡包埋。虽然这种方法对组织形态学来说是OK的,但不适合生物分子的提取。因为含有甲醛的固定剂会使生物分子形成交联,修饰核酸和蛋白。在组织固定、储存和处理过程中,交联引起核酸降解。因此,DNA、RNA和miRNA的完整性受损,影响了下游的分子分析,例如定量PCR 或 RT-PCR。其它的稳定剂如RNAlater虽保留了组织中的核酸,却不能保留组织形态。鱼和熊掌,怎可兼得?

为了既保持形态,又稳定分子,QIAGEN和BD的合资公司PreAnalytiX 开发出的PAXgene系列产品2009年又推出新品:PAXgene Tissue System。该系统由两部分组成:采集、稳定、储存和运输人类组织样品的组织采集装置-PAXgene Tissue Containers以及分别纯化总RNA或DNA或 miRNA的PAXgene Tissue 系列试剂盒。

PAXgene Tissue Containers是一种双腔容器,预装2种试剂,分别用于组织的固定和稳定。第一个腔PAXgene Tissue Fix 快速渗入并固定组织,时间为2-4小时(最多12小时)。固定之后,从PAXgene Tissue Fix 中取出组织并转移到第二个腔PAXgene Tissue Stabilizer中,进行生物分子和形态学的稳定。当组织储存于PAXgene Tissue Stabilizer时,组织的核酸和形态在室温下可稳定3-7天,在2-8°C条件下可稳定2-4周,稳定时间取决于组织类型。也可在 -20°C 的条件下至少保存3个月,甚至在-80°C保存数年,对组织形态和核酸完整性没有任何不良影响。稳定的样品可包埋到石蜡中,可以后续进行染色,或者免疫组化反应,用于组织形态学研究。当然,在石蜡包埋前后,都可从稳定样品中分离核酸。这相当于替代了福尔马林在固定组织切片的功能。第一次为这种传统方法提供了其他代替方案,并能更好地兼顾面向未来的分子生物学的进展!

PAXgene Tissue Containers既能固定组织,用于组织病理学研究,又能从同一个样品中纯化高品质核酸,用于分子分析,可谓鱼和熊掌皆可得。也许有人会担心PAXgene的固定质量不及甲醛。H&E染色结果很好地说明了一切(图1)。将人腭扁桃体的横切面一分为二。一半用PAXgene Tissue Container固定,另一半用甲醛固定。之后用石蜡包埋,切片,并用苏木精和曙红染色。图1表明PAXgene Tissue Container保留了完整的组织形态,其染色模式与甲醛固定组织相当。就免疫组化分析而言,PAXgene Tissue Containers固定组织的染色强度也与FFPE组织相当(图2)。

 
图1. PAXgene Tissue System的H&E染色结果与甲醛固定组织相当。
 

图2. PAXgene Tissue System的免疫组化结果与甲醛固定组织相当。人腭扁桃体组织用PAXgene Tissue Containers固定,或甲醛固定,石蜡包埋,采用LSAB方法染色。切片用苏木精复染。对于甲醛固定的样品,所有抗原都需要抗原修复,而PAXgene Tissue System中只有CD5需要。

组织形态分析完毕,下一步就轮到核酸纯化了。目前有三种PAXgene Tissue Kits 纯化试剂盒,从组织中分别纯化总RNA、miRNA或DNA。

PAXgene Tissue RNA Kit 能从固定和稳定于PAXgene Tissue Containers中的组织中纯化总RNA。其流程如下:首先进行组织样品的破碎和匀质化,离心之后去除细胞碎片,在裂解液中添加乙醇,确保合适的RNA结合条件。然后将样品上样到PAXgene RNA MinElute 离心柱,总RNA结合到膜上,有效去除杂质。在两次洗涤步骤之间,用DNase处理膜,去除少量结合的DNA。洗涤之后,用低盐洗脱液洗脱RNA,并加热至65°C让RNA变性。

使用PAXgene Tissue RNA Kit 纯化的总RNA纯度非常高,与CsCl梯度离心相当,其中基因组DNA的污染降至最低,纯化所得的RNA可直接用于多种下游分析,包括RT-PCR及定量RT-PCR,表达谱芯片分析,Northern、dot和slot blot分析以及引物延伸等。该试剂盒可分离出所有大于200 nt的RNA分子,并选择性地分离出大部分小于200 nt的核酸(诸如5.8S rRNA、5SrRNA和rRNA,这些占总RNA的15-20%)。不过,对于专门的小RNA纯化,我们还是推荐使用PAXgene Tissue miRNA Kit。

PAXgene Tissue miRNA Kit 的流程基本同上,不过它采用了优化的结合和洗涤条件,可分离出所有大于18 nt的RNA分子,特别适合目前热门的miRNA研究。纯化所得的miRNA和总RNA可直接用于下游分析,包括Northern blot分析、定量RT-PCR以及芯片分析等,未检测到PCR抑制。

至于基因组DNA的分离,PAXgene Tissue Containers收集和稳定组织后,PAXgene Tissue DNA Kit接下来进行DNA的分离和纯化。在裂解缓冲液中进行组织裂解,并利用蛋白酶K进行消化。结合缓冲液及乙醇的缓冲条件可调整,以确保提供最佳的DNA结合。然后将裂解液上样到PAXgene DNA离心柱上。在离心过程中,DNA会选择性地结合到硅胶膜上,杂质则流过柱子。用洗涤缓冲液进行2次高效的洗涤,去除残留的杂质和酶抑制剂,最后低盐洗脱缓冲液洗脱,获得的DNA可直接用于下游应用,包括各种PCR、Southern blotting及SNP基因分型等。

了解PAXgene系统的更多信息!

PAXgene Tissue DNA Kit纯化所得的总DNA纯度非常高,A260/A280比例达1.7-1.9,同时吸光度扫描显示其在260 nm有对称峰,证实是高纯度的基因组DNA。纯化过程中高分子量的基因组DNA得以保留,PCR能扩增出>21 kb的条带,而FFPE样品则望尘莫及,只能是一条长长的拖尾(图3),表明该试剂盒纯化出的DNA适合长片段PCR。
 

图3. 基因组DNA扩增后的琼脂糖电泳图。人腭扁桃体标本分别用PAXgene Tissue System或甲醛处理。利用PAXgene Tissue DNA Kit提取石蜡包埋切片中的总DNA;对于甲醛处理的扁桃体,则用一种市售的适合FFPE组织的DNA提取试剂盒。前者扩增出了21 kb的片段,而FFPE样本则降解。

让我们也借这个机会回顾一下PreAnalytic公司的PAXgene系列产品:

PAXgene Blood RNA Tubes大家都不陌生,它们包含了裂解血细胞并立即稳定RNA的混合试剂。对于下游的基因谱表达分析而言,RNA稳定相当关键。如果不稳定,RNA会立即降解,转录本就会发生上调或下调。而PAXgene Blood DNA管中采集的血液样本可在室温下储存长达3天,或在–20°C/–70°C储存至少50个月,却没有明显的RNA降解或转录水平的改变。

稳定之后,下一步就是利用PAXgene硅胶膜技术PAXgene Blood RNA Kit,简单的离心操作。纯化18 nt以上的总RNA。只要是长于18个核苷酸的RNA分子,这个试剂盒都不会放过,因此miRNA自然也难逃掌心。miRNA可用QIAGEN miScript PCR System或其它的定量RT-PCR系统来分析,也可进行表达谱分析。

PAXgene系统也提供DNA血液稳定和纯化的系列产品,但是目前看来,收集血液时候即加入抗凝剂是比较常见的操作,而加入抗凝剂的血不需要使用PAXgene的系统了。虽然,从保存核酸分子稳定的能力来看,PAXgene系统确实独树一帜。

另外,骨髓的稳定和RNA纯化的任务有PAXgene Bone Marrow 系统完成。收集在PAXgene Bone marrow Tube中后续用PAXgene Bone Marrow RNA Kit纯化。

随着miRNA研究的持续升温,与血液打交道的研究人员也急切盼望有一种标准化方法,从人血液样品中纯化小分子RNA。为此,PreAnalytiX公司新推出了PAXgene Blood miRNA Kit。它与PAXgene Blood RNA Tubes的强强联手,整合了血液的采集、稳定和运输,以及随后miRNA的富集。纯化是利用硅胶RNA纯化技术在离心柱中进行的。纯化可手工进行,也能在QIAcube中自动开展。

组织形态,我所欲也,分子信息的获得和分子水平的分析,亦我所欲也。有了PAXgene系统,二者皆可得,不用再做困难的取舍。

PAXgene系统为您带来一个样品的两个美妙世界!(生物通 余亮)

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