GST融合表达全攻略之检测[选购宝典]

前面谈到了GST融合蛋白的表达和纯化，这一次说说GST的检测，以及GST标签的去除。

GST的检测

抗-GST抗体
抗-GST抗体是纯化自山羊血清的多克隆抗体，用于重组GST标签蛋白的高灵敏、高特异检测。多克隆抗体的优势在于它能识别不同的GST表位，因此即使某些结合位点由于蛋白折叠被掩盖住，GST标签蛋白也还能检测。抗-GST抗体经过大量的交叉吸附，以去除与大肠杆菌蛋白结合的抗体，并经过Glutathione Sepharose层析填料的亲和纯化。抗-GST抗体以未结合的形式提供，可与酶结合的抗山羊抗体共同使用，推荐用于Western blot和dot blot（图1）。

图1. 含有GST标签蛋白的大肠杆菌裂解液的Western blot。为了检测，使用了抗-GST抗体，碱性磷酸酶结合的抗山羊IgG，及CDNB/NBT底物。

GST 96孔检测块
GST 96孔检测块允许对多个样品的GST融合蛋白进行快速灵敏的测定。澄清的裂解液或中间的纯化片段可直接上样至GST 96孔检测板中。每孔中固定在壁上的抗-GST抗体捕获了GST标签蛋白。捕获的GST标签蛋白用检测块中提供的HRP/抗-GST结合物来检测。用作为对照的重组GST（rGST）可绘制出定量GST标签蛋白的标准曲线（图2）。产品中含有5块板和试剂。

图2. 利用GST 96孔检测块灵敏地检测重组GST。所示量的rGST蛋白直接上样到GST 96孔捕获板的孔中。结合及洗涤之后，孔用HRP/抗-GST结合物来处理，并加入TMB底物进行检测（A450）。

GST检测块
GST检测块实现了GST融合蛋白的灵敏检测，含有供生化分析（其中谷胱甘肽和CDNB作为GST的底物，产生可在340 nm检测的黄色产物）或免疫分析检测的组分。GST检测块包含足够这两种分析的50次检测反应的组分，以及一份操作指南小册子。

GST标签的去除

GST标签的去除可在目的蛋白的功能或结构研究之前进行。根据目的蛋白的性质不同，完全消化所需的蛋白酶量、温度、及孵育长度也各异。

含有PreScission蛋白酶、凝血酶或Xa因子识别位点的标签蛋白可在与Glutathione Sepharose层析填料结合时切割，或者洗脱后在溶液中切割。当GST蛋白与柱结合时，切割释放了目的蛋白，它与结合缓冲液一起洗脱，而GST部分仍与填料结合。一般来说，柱上切割是推荐使用的方法，因为许多潜在的杂质都能洗掉，目的蛋白在洗脱时具有更高的纯度。如果需要优化切割条件，建议洗脱后切割。

从蛋白或肽段制备中去除丝氨酸蛋白酶如凝血酶、Xa因子和PreScission蛋白酶，可利用Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow来进行，此填料有大包装。为了方便，Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow也有预填充的HiTrap Benzamidine FF 1 ml和 5 ml柱。

凝血酶
凝血酶能够对带有可接近的凝血酶识别序列的融合蛋白进行位点特异的切割，用于消化包含凝血酶识别序列的pGEX载体所制备的GST标签蛋白（pGEX-1λT、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2及pGEX-4T-3）。在22°C，1×PBS中，一个单位的酶16小时可切割100 μg待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。

Xa因子
纯化自牛血浆的Xa因子特异切割四肽Ile-Glu-Gly-Arg之后的蛋白，可用于消化包含此序列的pGEX载体所制备的GST标签蛋白（pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2和pGEX-5X-3）。在22°C，1 mM CaCl2、100 mM NaCl和50 mM Tris-HCl（pH 8.0）的反应体系中，一个单位的酶16小时可切割100 μg待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。

PreScission蛋白酶
PreScission蛋白酶是一种遗传改造的融合蛋白，由人鼻病毒3C蛋白酶和GST组成。这种蛋白酶是专为蛋白酶的去除而设计，能实现同时的蛋白酶固定和pGEX-6P载体（pGEX-6P-1、pGEX-6P-2和pGEX-6P-3）所产生的GST融合蛋白的切割。PreScission蛋白酶特异切割Glu和Gly残基之间的识别序列LeuGluValLeuPheGlnGlyPro。蛋白酶在4°C具有最大活性，因此切割在低温下进行，改善了目的蛋白的稳定性。在5°C，50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT（pH 7.0）的反应体系中，一个单位的酶16小时可切割100 μg待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。

GST融合表达全攻略到此结束。如需详细的产品资料，请点击此处索取。

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