GE推出富集多种蛋白的Mag Sepharose磁珠[新品推荐]

Protein A Mag Sepharose，Protein G Mag Sepharose和NHS Mag Sepharose是为简化免疫沉淀或pull-down应用中目的蛋白的富集而设计的磁珠。固定在Mag Sepharose磁珠上的抗体或其它蛋白用于目的蛋白的捕获，随后利用磁性装置收集磁珠。

Mag Sepharose磁珠的主要优势在于：
• 可见且密度大，易于辨认和收集结合的目的蛋白
• 非附着的磁珠避免了剪切作用和聚集物形成。使用时无需去污剂。
• 轻松捕获小体积或大体积样品中的目的蛋白（低至微升，高至毫升）
• 为富集/免疫沉淀目的蛋白而优化过的容量——只需少量的抗体
• 灵活的步骤，洗脱条件为电泳和质谱分析而优化

每种磁珠目前都有两种包装规格：1×500 μl浆体，适合20个样品；4×500 μl，适合80个样品。再加上MagRack 6，一种处理微量离心管中磁珠的分离工具，每次能平行处理最多6个样品。

目的蛋白的可靠捕获
Protein A Mag Sepharose和Protein G Mag Sepharose是亲和层析填料（树脂），带有蛋白A或蛋白G配体，这两者对单克隆或多克隆抗体都有着高亲和力。Mag Sepharose填料的蛋白A或蛋白G配体上固定的抗体可用于免疫沉淀中目的蛋白的捕获。NHS Mag Sepharose是为任何含有自由氨基的蛋白或生物分子的共价偶联而设计的，可用于多种类型的pull-down实验。点击索取说明书

简化的操作
磁珠形式有着适合小规模实验的杰出性质。磁珠的高密度允许磁性装置的快速捕获，而磁珠的可见性确保了免疫沉淀/pull-down应用中所有结合的目的蛋白的可靠收集。这实现了低丰度目的蛋白样品的浓缩，从毫升降至微升。从25 ml样品起始，可以获得体积低至2.5 μl的富集产物。填料的特征总结在表1。

所有产品都提供了为下游分析（如MALDI-ToF和LC-MS）的样品制备而优化的操作步骤。

MagRack 6最多能够制备1.5 ml微量离心管所捕获的6个样品。当离心管放置在架子上时，磁珠在几秒钟内被吸引到磁铁上。这样能轻松去除上清，而磁珠保留在管内。对于更大的样品体积，在结合目的蛋白时可使用50 ml塑料管。在目的蛋白的初次捕获之后，推荐使用磁力贴，将磁珠转移至更小的管中。或者可利用外摆式的离心机让磁珠旋转下沉。

为了操作更方便，还有Protein A/G SpinTrap Buffer Kit和NHS SpinTrap Buffer Kit可供选择。这些缓冲液试剂盒省去了耗时的缓冲液制备，从而促进了快速、重复性高的蛋白富集。

表1. Protein A Mag Sepharose，Protein G Mag Sepharose和NHS Mag Sepharose的特征

Protein A Mag Sepharose
• 基质      顺磁、高度交联琼脂糖的球形颗粒
• 配体      天然的蛋白A
• 结合能力   8-17 mg人IgG/ml凝胶
• 颗粒大小   37-100 μm
• 工作温度   室温
• 储存液     20%乙醇
• 储存温度   4-8 °C

Protein G Mag Sepharose
• 基质     顺磁、高度交联琼脂糖的球形颗粒
• 配体     蛋白G
• 结合能力  13-22 mg人IgG/ml凝胶
• 颗粒大小  37-100 μm
• 工作温度  室温
• 储存液    20%乙醇
• 储存温度   4-8 °C

NHS Mag Sepharose
• 基质     顺磁、高度交联琼脂糖的球形颗粒
• 配体     N-羟基琥珀酰亚胺
• 结合能力  8-14 μmol/ml凝胶
• 颗粒大小  37-100 μm
• 工作温度  室温
• 储存液    2-丙醇
• 储存温度   4-8 °C

灵活的操作步骤
对于Protein A Mag Sepharose或Protein G Mag Sepharose，有两种蛋白富集的操作步骤可供选择：(1) 交联步骤，其中目的蛋白被洗脱，而抗体仍通过交联剂共价结合在基质上，(2) 经典步骤，其中目的蛋白与抗体一起洗脱。

NHS Mag Sepharose是预先激活的，来自不同物种的蛋白、抗体和适体（aptamer）可通过主要的氨基共价偶联。在第二步中，目的分子被亲和捕获，并在交联步骤中洗脱。

蛋白富集的最佳参数取决于样品中存在的生物分子的特定组成。因此针对每种特定组成，需要优化缓冲液，以便获得最佳结果。产品操作说明中列出了推荐的缓冲液。

重复性好的蛋白富集：标杆分析
为了展示效率和重复性，通用电气医疗集团的实验室通过运行9次重复，评估了Protein A Mag Sepharose。用Dynabeads™ Protein A（Invitroge公司）设立了平行实验，作为比较。

利用兔抗人转铁蛋白的多克隆抗体，从非标记的大肠杆菌蛋白背景下富集用Cy™5染料标记的人转铁蛋白。对于两种填料，都采用了交联步骤，并根据产品附带的操作指南处理每种填料（表2）。洗脱的组分用SDS-PAGE（ExcelGel™）来分析，用Deep Purple™总蛋白染料进行后染，并用Ettan™ DIGE Imager扫描。

Protein A Mag Sepharose与Dynabeads Protein A相比，显示出明显更高的回收率，两者的回收率分别为53%和20%（图1）。纯度与纯度平均值几乎是相同的，Protein A Mag Sepharose为52%，Dynabeads Protein A为50%。

表2. 实验条件

	Protein A Mag Sepharose	Dynabeads Protein A
分离填料	25 μl凝胶浆体，Protein A Mag Sepharose	50 μl凝胶浆体，Dynabeads Protein A
样品	5 mg/ml大肠杆菌蛋白，含有7.5 μg/ml人转铁蛋白	5 mg/ml大肠杆菌蛋白，含有7.5 μg/ml人转铁蛋白
样品体积	200 μl	200 μl
抗体	兔抗人转铁蛋白的多克隆抗体	兔抗人转铁蛋白的多克隆抗体
结合缓冲液	Tris缓冲盐（TBS）：50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.5	0.1 M磷酸钠，0.01% Tween™ 20，pH 8.2
洗涤缓冲液	TBS，2 M 尿素，pH 7.5	磷酸盐缓冲液（PBS）
洗脱缓冲液	2×50 μl 0.1 M 甘氨酸/HCl，2 M 尿素，pH 2.9	2×50 μl 0.1 M 甘氨酸/HCl， pH 2.9

图1. Protein A Mag Sepharose（蓝色）和Dynabeads Protein A（红色）之间关于人转铁蛋白的(A) 回收率和(B) 纯度的比较。

在复杂的混合物中发现低丰度的酪氨酸磷酸化蛋白
活跃在信号通路中的蛋白一般不会在无样本制备的情况下被SDS-PAGE或质谱分析检测到，因其丰度低。

Protein G Mag Sepharose填料及固定的抗-pTyr抗体用于富集和浓缩酪氨酸磷酸化的蛋白，并以适合质谱分析的体积洗脱。

CHO细胞（7×10⁷）用100 μM过钒酸盐预处理3小时，之后收集并裂解。裂解液，包括蛋白酶和磷酸酶抑制剂，通过离心来澄清，并稀释两倍，再与Protein G Mag Sepharose上固定的抗-pTyr抗体在室温下共同孵育60分钟（滚动）。用2×100 μl 100 mM磷酸苯酯洗脱酪氨酸磷酸化的蛋白。在LC-MS/MS分析之前进行胰酶消化。制备未处理的细胞，作为对照。

质谱鉴定得到76个潜在酪氨酸磷酸化蛋白的hits，其中54个只在过钒酸盐处理过的细胞中发现（数据未显示）。这些蛋白中的大部分属于焦点的粘附相关的通路。未处理的细胞只得到22个hits，大部分是高丰度酶和核糖体蛋白。

结合抗-pTyr抗体，Protein G Mag Sepharose是一种很有力的工具，能从大量起始样品中捕获参与了不同信号通路的低丰度蛋白。

从人血浆中富集血纤维蛋白溶酶原（plasminogen）
NHS Mag Sepharose显然是血浆样品进行免疫沉淀的首选，因为内源的免疫球蛋白可能会与Protein A Mag Sepharose或Protein G Mag Sepharose上剩余的自由配体结合。此外，一些抗体比如小鼠IgG1，众所周知在正常条件下与Protein A和Protein G的结合不佳。

人血浆中含有大量蛋白，因蛋白浓度的范围广，可能很难处理。这个免疫沉淀实验显示，利用NHS Mag Sepharose上偶联的小鼠单克隆抗体，能有效地从血浆样品中富集血纤维蛋白溶酶原。

利用NHS Mag Sepharose上共价偶联的抗血纤维蛋白溶酶原小鼠IgG1单克隆抗体，从人血浆中富集血纤维蛋白溶酶原。在平行实验中，相同的抗体被Protein A Mag Sepharose捕获。抗体首先与1.2 M KH2PO4混合，以便增加小鼠IgG1抗体与蛋白A配体的亲和力，然后抗体交联。

为了去除内源的IgG，样品在HiTrap™ Protein A HP柱上澄清。两个富集实验的组分都在SDS-PAGE上分析（图2）。血纤维蛋白溶酶原进一步由LC-MS/MS鉴定。

两种实验设置确保了目标蛋白的高水平富集。操作步骤稍作改动后，可克服小鼠单克隆IgG1与蛋白A的亲和力差。

A. NHS Mag Sepharose
• 亲和填料：25 μl NHS Mag Sepharose
• 样品：人血浆
• 样品体积：6 ml
• 抗体：抗血纤维蛋白溶酶原的小鼠单克隆IgG1
• 偶联缓冲液：0.15 M 三乙醇胺，0.5 M NaCl，pH 8.3
• 结合缓冲液：Tris缓冲盐（TBS：50 mM Tris，150 mM NaCl，pH7.5）
• 洗涤缓冲液：TBS，2 M 尿素，pH 7.5
• 洗脱缓冲液：2×50 μl 0.1 M 甘氨酸/HCl，2 M 尿素，pH 2.9

B. Protein A Mag Sepharose
• 亲和填料：25 μl Protein A Mag Sepharose
• 样品：人血浆
• 样品体积：10 ml
• 抗体：抗血纤维蛋白溶酶原的小鼠单克隆IgG1
• 结合缓冲液：1.2 M KH2PO4，pH 9（增加小鼠IgG1和蛋白A的亲和力）
• 洗涤缓冲液：TBS，2 M 尿素，pH 7.5
• 洗脱缓冲液：2×50 μl 0.1 M 甘氨酸/HCl，2 M 尿素，pH 2.9

图2. 从人血浆中富集血纤维蛋白溶酶原。(A) NHS Mag Sepharose的SDS-PAGE结果。(B) Protein A Mag Sepharose的SDS-PAGE结果。凝胶用Deep Purple蛋白染料后染，并用Ettan DIGE Imager扫描。箭头指示出血纤维蛋白溶酶原的位置。