Nature:实时捕捉RNA翻译过程

【字体: 时间:2010年06月23日 来源:生物通

编辑推荐:

  来自斯坦福大学医学院结构生物学系,日本科学技术机构(Japan Science and Technology Agency,简称JST),约翰霍普金斯大学医学院的研究人员利用一种新型技术,实时观测到了单个核糖体如何将氨基酸串联起来的过程。这一研究成果公布在Nature杂志上。

  

生物通报道:来自斯坦福大学医学院结构生物学系,日本科学技术机构(Japan Science and Technology Agency,简称JST),约翰霍普金斯大学医学院的研究人员利用一种新型技术,实时观测到了单个核糖体如何将氨基酸串联起来的过程。这一研究成果公布在Nature杂志上。

文章的通讯作者是来自斯坦福大学医学院的结构生物学家Joseph D. Puglisi,这位在RNA结构生物学研究领域获得了许多重要成果的科学家一直都希望能够解析RNA各种活动和功能的结构变化过程。

RNA是自然界中最忙碌的分子之一。一度被相信只不过是贮存与传送遗传资讯而已,不过现在已知它能完成其它多样化的功能,从调控基因表达与其它维持生命所必需的细胞程序到作为一种感应器,那能够检测细胞信号并完成应答应。

这个多才多艺的分子其中一项重要的功能就是在于蛋白翻译过程,自上个世纪以来,蛋白翻译过程就已经活动了许多重要的成果,一些已经进行到了单分子水平,去年的诺贝尔化学奖就颁给了在这方面获得突出成果的两位科学家(核糖体结构和功能的研究)。但是至今科学家们对于这个快速高效的过程依然存在许多疑问,尤其是在一些低浓度水平中,RNA是如何完成翻译周期的这一迷题。

在这篇文章中,研究人员利用一种称为零级波导 (zero mode waveguide, ZMW),实时观测到了单个核糖体如何将氨基酸串联起来的过程。这不仅可以解析tRNA在翻译过程中的具体结构变化,而且还可以为今后研究药物对蛋白翻译过程中的影响起到重要的作用。

这种零级波导ZMW技术实际上是用于一种新一代测序技术:单分子实时技术(single molecule real time, SMRT)中的一种方法,ZMW是一种纳米结构,能用于观测DNA的聚合。这个结构(如下图)中,DNA聚合酶被锚定ZMW小孔的底部,当各种不同的被标记的核苷酸通过弥散作用进入ZMW小孔之后,占据了图中白色的探测区域。当核苷酸被掺入到DNA链,即发生了聚合反应时,这些被标记的核苷酸会在小孔的探测区域中被聚合酶滞留数十毫秒。在每一个核苷酸掺入之后,标记在核苷酸末端的磷酸盐会被切除,弥散出ZMW小孔。

这种由Pacific Biosciences公司推出的单分子实时技术在高速测序、长序列产出和低成本方面有着巨大的潜力。不过与其他单分子测序平台一样,实时检测单个分子对于提高原始数据准确率是一个挑战,并可能成为一个障碍,这需要更进一步的改进。

最新的这项研究将这一技术与RNA翻译过程结合起来,研究人员在一个微室中将大肠杆菌的核糖体复合物固定,这一起始N-甲酰基蛋氨酸(fMet)tRNA的70S起始复合物带有荧光基团标记,并且研究人员还添加了另外两个tRNA,用不同的染料来标记,这些tRNA与被检测的mRNA编码的氨基酸——苯丙氨酸和赖氨酸同源。

上图左边是这一实验的具体流程,右边是预期的信号分析。研究人员首先检测出fMet tRNA信号,之后又尝试了把每种tRNA结合核糖体标记上之后,就可以检测mRNA,这些荧光信号能检测出tRNA。当每一个被标记的tRNA与被固化在一个ZMW的核糖体结合时,一个清晰的分离信号被记录下来。随着时间延长,由tRNA占据的核糖体位点被监测荧光信号所延伸。

这个过程是在微反应室(10–21)中进行了,因此可以在接近生理浓度的水平下进行单分子的实时观测,从而研究人员可以利用这一方法作为生物物理学测量法来得到关于翻译动力学的信息,也分析mRNA的基本序列,从而解析依赖于序列的翻译行为。研究小组还将这个系统扩展至四种染料,这样就可以分析药物是如何影响翻译的,以及相关的其它问题。另外这个系统也可以被用来分析系列过程,从起始到框架转换,以及包括真核生物的核糖体在内的不同物种的核糖体。

ZMW技术在观测核酸分子方面确实具有优势,由于是被固定在细小的孔内,这样就非常容易借助适当浓度的荧光标记核苷酸对它们进行成像观察,而且成像的背景噪声非常低。利用这种方法获得测序仪能以2-4个碱基/每秒的测序速度对环状或线状模板进行实时的精确测序。虽然仪器的每一次读数都有出现错误的可能,但由于同时进行了多次测序,所以能得到准确率非常高的结果。

但是这一方法也存在其缺陷性,比如当前的CCD技术也限制了同时观察零级波导的最大面积,聚合酶所占据的零级波导比例较低(约 30%)也限制了可用的波导数量,这些都成为提高SMRT技术数据通量的限制。

不过2010年推出的ZMW测序第一个版本的设备的序列读长将不低于1500个碱基, 一次测序只要15分钟,每次测序的实际成本不超过60美元,当这些技术问题都被解决的时候, 预计未来版本的设备每天可能产出100G的数据,而序列读长将达到10万碱基。

因此可以说ZMW技术在核酸检测等各个系统中具有良好的应用广泛性,也许未来利用这一技术,我们还能检测更多的生物系统,了解更多生命的奥秘。

(生物通:万纹)

原文摘要:

Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution

Translation by the ribosome occurs by a complex mechanism involving the coordinated interaction of multiple nucleic acid and protein ligands. Here we use zero-mode waveguides (ZMWs) and sophisticated detection instrumentation to allow real-time observation of translation at physiologically relevant micromolar ligand concentrations. Translation at each codon is monitored by stable binding of transfer RNAs (tRNAs)—labelled with distinct fluorophores—to translating ribosomes, which allows direct detection of the identity of tRNA molecules bound to the ribosome and therefore the underlying messenger RNA (mRNA) sequence. We observe the transit of tRNAs on single translating ribosomes and determine the number of tRNA molecules simultaneously bound to the ribosome, at each codon of an mRNA molecule. Our results show that ribosomes are only briefly occupied by two tRNA molecules and that release of deacylated tRNA from the exit (E) site is uncoupled from binding of aminoacyl-tRNA site (A-site) tRNA and occurs rapidly after translocation. The methods outlined here have broad application to the study of mRNA sequences, and the mechanism and regulation of translation. 

相关新闻
生物通微信公众号
微信
新浪微博
  • 搜索
  • 国际
  • 国内
  • 人物
  • 产业
  • 热点
  • 科普

热搜:蛋白合成|

  • 急聘职位
  • 高薪职位

知名企业招聘

热点排行

    今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

    版权所有 生物通

    Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

    联系信箱:

    粤ICP备09063491号