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划时代的RNA原位杂交技术[新品推荐]
【字体: 大 中 小 】 时间:2011年01月12日 来源:生物通
编辑推荐:
Panomics 公司的 QuantiGene ViewRNA 是一种新型 RNA原位杂交技术,融合了传统RNA原位杂交技术与FISH技术的优点。基于正在申请专利的探针组设计与专有的信号放大方法,在准确性、灵敏度、重复性等方面都大幅提高,可以在单细胞中对多个目标基因的低拷贝乃至单拷贝RNA做出检测。整个实验流程与FISH相似,但时间大大缩短。
一.概述
1. RNA原位核酸杂交
RNA原位核酸杂交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又称RNA原位杂交组织化学(RNA in situ hybridization histochemistry)或RNA原位杂交(RNA in situ hybridization RISH)。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是:在细胞或组织结构保持不变的条件下,用标记的已知的RNA核苷酸片段,按核酸杂交中碱基配对原则,与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交),所形成的杂交体经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。
RNA原位杂交技术经不断改进,其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析,已成为最有效的分子病理学技术,同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一个重要方向。
RNA原位杂交不同于DNA原位杂交主要有:
(1)检测目的不同:RNA原位杂交检测和分析的主要为内源性基因,包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能、代谢状态、探索疾病发病机理、观察治疗疗效和评估疾病预后等。其次为对外源性基因检测,以获得病毒和细菌类型等病原学诊断。而DNA原位杂交主要为外源性基因检测。
(2)有较高的灵敏度:在检出细胞和组织内低拷贝核苷酸时,RNA原位杂交能获得较好定位,而DNA原位杂交则难以信任。
(3)使用的探针不同:RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针,因此避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。cRNA-RNA之间形成的杂交体要比DNA-DNA、cDNA-RNA杂交体性能稳定,在杂交反应后可用RNA酶洗脱,以除去未结合的探针,因此特异性更强。
2.荧光原位杂交
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一门新兴的分子细胞遗传学技术,是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
与传统的放射性标记原位杂交相比,荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点,因此在生物、药物研究领域受到普遍关注。
3.QuantiGene ViewRNA
Panomics 公司的 QuantiGene ViewRNA 是一种新型 RNA原位杂交技术,融合了传统RNA原位杂交技术与FISH技术的优点。基于正在申请专利的探针组设计与专有的信号放大方法,在准确性、灵敏度、重复性等方面都大幅提高,可以在单细胞中对多个目标基因的低拷贝乃至单拷贝RNA做出检测。整个实验流程与FISH相似,但时间大大缩短。
这个划时代的技术使人们对基因研究有了突破性的进展。
(1)这项新技术可主要应用于以下领域:
·细胞的转录谱分析
·体内外 RNAi 传递和基因敲除
·生物标记物研究
·报告基因筛选
·分子病理学
·干细胞分化
·细胞生物学
·神经生物学
(2)较传统技术,这项新技术具有以下优点:
a. 对细胞样本
·悬浮或贴壁的培养细胞,血液细胞组织(即将推出)
·单细胞水平检测单拷贝的RNA
·双“ZZ”探针,准确性高
·同时检测最多达4个基因
·极佳的信噪比
·可在载玻片与多孔板上检测
·荧光显微镜检测
·在抗体无法得到的情况下,对免疫细胞化学研究是一种极好的补充
b. 对福尔马林固定,石蜡包埋样本
·FFPE石蜡包埋组织切片
·单基因原位检测
·检测下限可达10拷贝/细胞
·双“ZZ”探针,准确性高
·光学显微镜/荧光显微镜
二.实验流程
三.实验结果展示
1. 同时检测Hela细胞中4种不同的管家基因表达情况RPLO(绿色),PPIB HPRT(黄色),HPRT (浅绿色),β-actin (红色)
2. 在多通道原位杂交测定中,可同时检测 HeLa(左上)和 SKBR3(右上)细胞中的 Her-2 mRNA(绿色)和 18S rRNA(红色),并通过荧光显微镜观察记录。 对于含量极高的 18S rRNA,它在整个细胞质中呈现弥散着色;相比之下,含量较少的 Her-2 mRNA 则呈现与预期mRNA 表达水平相关的点状图案,每个点对应一个拷贝Her-2 mRNA(如图所示)。 在图4中,用针对Her-2 内含子序列的互补探针组做为阴性对照。 在所有板中,细胞核(蓝色)是用 DAPI 染色。
3. PMA处理Hela细胞后,不同时间段IL-6和IL-8的表达水平。
4. ViewRNA组织切片水平检测结果,FastRed显色位置即为该目的基因表达区域,几乎没有背景影响,并且得到的结果非常精确。
四.用户发表文章(例选)
Piotrowska, J., et al., Stable formation of compositionally unique stress granules in virus-infected cells. J Virol, 2010. 84(7): p3654-65.
Taylor, A.M., et al., Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J Neurosci, 2009. 29(15): p4697-707.