冷泉港1月实验方案聚焦器官培养和NanoCAGE[创新技巧]

冷泉港实验方案（Cold Spring Harbor Protocols）发布了最新的1月实验方案，其中一个是关于小鼠胚胎肾的器官培养和免疫染色，另一个则介绍了CAGE技术的改进版 – NanoCAGE技术。

Organ Culture and Immunostaining of Mouse Embryonic Kidneys

这个实验方案是由美国华盛顿大学医学院发育生物学系的Hila Barak和Scott C. Boyle提供的。

哺乳动物的器官发育研究能够在完整器官的背景下了解多个基本的细胞生物学过程。这在遗传学的时代特别重要，因为小鼠中的基因缺失或突变可直接与人类先天畸形相关联。体外培养某些器官的能力已经成为一种重要的工具，能了解组织如何构建，以及信号通路如何调控这些过程。这对于通过分支形态发生机制培养的器官（如肺和肾）特别有用。

作者介绍了小鼠胚胎12.5天（E12.5）肾的分离、体外培养和荧光免疫染色。为了利用活体成像显示肾形成，他们从携带GFP转基因的小鼠中分离出肾并培养。他们还提供了一种可靠的步骤，在全标本包埋下对多个肾结构进行成像。这些技术可作为分析小鼠模型中分支形态发生和肾形成的基本平台。

NanoCAGE: A High-Resolution Technique to Discover and Interrogate Cell Transcriptomes

CAGE的全称是cap analysis of gene expression，最早是由日本科学家Hayashizaki等发表在《PNAS》杂志上的。顾名思义，它是有关5’帽子的分析。CAGE是一种使用在分子生物学中的技术，能产生样品中mRNA的5’端快照。这种技术实现了高通量的基因表达分析以及转录起点的图谱分析。

然而，在应用过程中，研究人员也发现了一些问题。CAGE需要大量的起始材料，大约50 μg总RNA，这就阻碍了一些样品量有限材料的转录组分析。为此，Hayashizaki等开发出一种小规模的CAGE，称为nanoCAGE 2，这种方法能够捕获低至10 ng总RNA的5’端转录本。

这一次，来自日本横滨理化研究所（RIKEN Yokohama Institute）的Charles Plessy等发表了NanoCAGE的详细步骤。与标准方法不同，nanoCAGE采用了模板转换（template-switching）方法来捕获分子的5’端。操作流程如下图。

在第一链cDNA合成反应中加入模板转换寡核苷酸（TS Oligo）和逆转录引物。TS Oligo 3’端的3个鸟苷酸以帽依赖的方式与新合成cDNA链3’端的脱氧胞苷杂交。之后，逆转录酶利用TS Oligo作为模板，延伸cDNA链。因此，cDNA 3’端的序列与TS Oligo的序列反向互补。这些序列是合成和扩增第二条链所必需的。点击文章标题可免费查看详细的步骤。（生物通 薄荷）