杜立林研究组DNA Repair报道新方法

　　

生物通报道：来自北京大学、清华大学和北京生命科学研究所的研究人员发表题为“Multiple end joining mechanisms repair a chromosomal DNA break in fission yeast”的文章，首次报道了一个在裂殖酵母中检测染色体上进行的末端连接修复的方法，并利用此方法分析了机理不同的三类末端连接修复方式。这一研究成果公布在《DNA Repair》杂志上。

文章的通讯作者是北京生命科学研究所杜立林研究员，其早年毕业于南开大学生物系，2007年加入北京生命科学研究所。这项研究结果主要由北京大学、清华大学和北京生命科学研究所联合培养博士研究生项目（PTN-BBS）2011级研究生李鹏在轮转期间完成，其他贡献者有北京生命科学研究所研究生李俊，李明，窦坤，和生物信息分析员张美俊和索芳。文中样品的高通量测序工作由北京生命科学研究所测序中心完成。

非同源末端连接（NHEJ）是哺乳动物中修复DNA双链断裂的主要方式。参与NHEJ的修复蛋白如Ku，ligase IV，XLF，和X家族DNA聚合酶在裂殖酵母中都是保守的。

在这篇文章中，研究人员通过表达一个高特异性的核酸内切酶来产生基因组上一个特定位置的双链断裂，建立了结合传统测序和高通量测序全面分析不精确修复产物序列的方法。对突变体中修复产物序列的分析验证了Ku，ligase IV和XLF在经典NHEJ中的核心作用，以及X家族DNA聚合酶Pol4在间隙填补(Gap Filling)中的重要作用。

研究发现在Ku或ligase IV缺失的突变体中，两种非NHEJ的另类末端连接仍能发生。其中一种方式利用了DNA断裂位置两侧的微同源（microhomology）序列并造成几百至几千碱基的缺失，另外一种方式则只在酶切位点处引入碱基置换。

这是首次报道一个在裂殖酵母中检测染色体上进行的末端连接修复的方法，并利用此方法分析了机理不同的三类末端连接修复方式。

杜立林研究组今年年初还在Nucleic Acid Research上发表文章，详细描述了课题组构建的可用于裂殖酵母的高效插入诱变工具。

在这项工作中，研究人员发现PB在裂殖酵母中具有转座活性。PB转座离开后在原位置极少改变DNA序列，研究人员利用这一特点在裂殖酵母中开发了一个基于PB的诱变系统。在这一系统中，PB的起始位置是在一个参与氨基酸合成的基因里，造成了细胞的营养缺陷；PB的转座会回复该基因的功能，这个特性方便了对于发生转座的细胞的筛选。

研究人员运用高通量测序技术分析了大量的转座子插入位置，发现在该系统中，PB转座没有明显的染色体偏好性。利用此诱变系统，他们筛选到位于klp5, klp6和dam1的能够增强细胞对微管解聚药物thiabendazole的抵抗性的PB插入突变。在另一个遗传筛选中，研究人员发现在wee1基因中插入PB能够抑制温度敏感突变cdc25-22的致死表型。在这两个筛选中，研究人员得到了所有预期的突变基因，体现了该PB诱变系统的实用价值。

（生物通：万纹）

原文摘要：

Multiple end joining mechanisms repair a chromosomal DNA break in fission yeast

Non-homologous end joining (NHEJ) is an important mechanism for repairing DNA double-strand breaks (DSBs). The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has a conserved set of NHEJ factors including Ku, DNA ligase IV, Xlf1, and Pol4. Their roles in chromosomal DSB repair have not been directly characterized before. Here we used HO endonuclease to create a specific chromosomal DSB in fission yeast and examined the imprecise end joining events allowing cells to survive the continuous expression of HO. Our analysis showed that cell survival was significantly reduced in mutants defective for Ku, ligase IV, or Xlf1. Using Sanger sequencing and Illumina sequencing, we have characterized in depth the repair junction sequences in HO survivors. In wild type cells the majority of repair events were one-nucleotide insertions dependent on Ku, ligase IV, and Pol4. Our data suggest that fission yeast Pol4 is important for gap filling during NHEJ repair and can extend primers in the absence of terminal base pairing with the templates. In Ku and ligase IV mutants, the survivors mainly resulted from two types of alternative end joining events: one used microhomology flanking the HO site to delete sequences of hundreds to thousands of base pairs, the other rejoined the break using the HO-generated overhangs but also introduced one- or two-nucleotide base substitutions. The chromosomal repair assay we describe here should provide a useful tool for further exploration of the end joining repair mechanisms in fission yeast.

作者简介：
杜立林
博士，研究员

教育经历
1992年 南开大学生物系 学士
1995年 中国科学院上海生物化学研究所 硕士
2001年 耶鲁大学分子生物物理学与生物化学系 博士

工作经历
2007年6月——至今 北京生命科学研究所研究员
2001-2007 美国斯克里斯普研究所Paul Russell博士实验室，博士后

研究概述
癌症的一个特征是基因组不稳定性。维持基因组稳定性需要细胞对DNA损伤作出正确的反应。细胞对DNA损伤作出的一种反应是激活检验点信号传导网络，进而协调DNA损伤修复与细胞周期进程。本实验室利用裂殖酵母来研究DNA损伤反应的机理。作为一种模式物种，裂殖酵母的优点包括：容易进行遗传学和细胞生物学分析，现成的功能基因组学工具，以及分布在世界各地的富有活力的研究同行。由于DNA损伤反应在真核生物进化过程中的保守性，用裂殖酵母获得的实验结果往往能够帮助我们认识人类基因的功能和更好地了解癌症的发病机制。

研究方向：
1.DNA双链断裂的修复机制
2.对基因组中脆弱位点的研究
3.高通量表型组分析