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miRNA qPCR的五个重要贴士[心得点评]
【字体: 大 中 小 】 时间:2011年12月19日 来源:生物通
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PCR成为目前开展miRNA表达谱分析的最常用方法。它灵敏快速,操作简单。当然,若想获得稳定可靠的结果,也须花费一番努力。为此,Exiqon公司的专家分享了成功开展miRNA qPCR的五条重要建议,为大家的研究助力。
PCR成为目前开展miRNA表达谱分析的最常用方法。它灵敏快速,操作简单。当然,若想获得稳定可靠的结果,也须花费一番努力。为此,Exiqon公司的专家分享了成功开展miRNA qPCR的五条重要建议,为大家的研究助力。
1. 选择适当数量的重复
使用重复的目的是消除差异引起的噪音。取决于样品的差异程度,它可能需要包含生物学和技术重复。具体需要哪种重复,这取决于实验中引入最大变异的步骤。样品本身需要生物学重复,而RNA提取、RT和PCR步骤需要技术重复。重复的数量取决于变异水平,但绝不能低于三个。如果只用了两个重复,且它们差异显著,那么就很难确定哪个是异常值。
2. 确定最佳的对照
在研究中应当使用阴性和阳性对照。阴性对照能用来显示污染,并确定每个分析的背景水平。使用哪个阴性对照要取决于实验,但一般应包括:
• 无酶对照:不含酶的RT反应,以检查DNA污染
• 无模板对照:不含模板的RT或PCR反应,以检查试剂是否存在污染,并显示引物二聚体
• mock对照:带有载体RNA(如MS2)的RT对照,以检查提取过程中使用的载体或其他RNA是否会增加背景
实验中也应当使用阳性对照,以检查样品的质量,并进行troubleshooting。阳性对照可以是合成的RNA spike-in。这是cDNA合成反应的对照,也很容易判断样品中是否存在PCR抑制剂。
3. 开展反应的质量控制
为了开展质量控制,应当监控扩增子的熔解温度(Tm)和分析效率。miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR系统中使用SYBR Green检测,这可以产生解离曲线,而不同运行之间特定扩增子的Tm应当相同。因此,Tm可用来验证是否获得了相同的扩增子。解离曲线应当只有一个峰,而不同仪器的Tm可能会有差异,这是因为不同的温度校准。
4. 选择良好的参考基因
选择最佳的参考基因或参考基因组合,这至关重要,它可实现miRNA定量分析的标准化。如果利用含有几百个miRNA的分析板进行筛选,标准化的最佳方法是取所有表达miRNA的平均值。在小型研究中,可使用一个或多个稳定表达的内源对照。这可从筛选研究中选择。如果未开展此类研究,则应当从文献中挑出一些候选参考基因。
5. 选择优秀的数据分析软件
适当的数据分析对您下结论很重要。利用高质量的数据分析软件进行数据分析,如Exiqon GenEx,可获得正确的miRNA图谱。
在Exiqon GenEx中,一个易用的互动助手将指导您导入数据,选择适当的参考基因,标准化及最后的数据分析。
通过简单的几步,Exiqon GenEx就能生成复杂的统计表以及可立即发表的图片,让您清晰地查看结果。
关于miRNA qPCR实验的更多指南,请联系康成生物(Exiqon中国代理商)索取。