多重定量PCR该如何开展?[心得点评]

【字体: 时间:2011年12月22日 来源:生物通

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  多重qPCR并不是单重反应的简单叠加,因为在一个反应管中,任何一个目标的扩增都能影响其他目标的扩增。让反应条件同时适合这么多个目标,这似乎不太容易,但使用qPCR预混液可能有帮助。大部分qPCR预混液能够在一些方面胜出,但很难是全部。如何选择最适合的那一个,生物通小编下面给出了一些建议。

随着定量PCR在不断改善,多重qPCR同样如此。多重qPCR是将几个PCR分析合在一起,同时扩增并独立检测目标,它在提高通量的同时也节省了样品。与单重qPCR相比,尽管它需要更多时间和精力,但用户得到了丰富的数据。

然而,多重qPCR并不是单重反应的简单叠加,因为在一个反应管中,任何一个目标的扩增都能影响其他目标的扩增。让反应条件同时适合这么多个目标,这似乎不太容易,但使用qPCR预混液可能有帮助。预混液为预先优化好的混合物,通常包含缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、MgCl2及其他专利的添加剂。

一些专业人士坦言,对于多个指标,包括qPCR效率、特异性、灵敏度、速度及耐受多个循环条件和样品类型,目前还尚未实现完美的平衡。大部分qPCR预混液能够在一些方面胜出,但很难是全部。如何选择最适合的那一个,生物通小编下面给出了一些建议。

探针还是染料?

当然,就多重分析而言,探针法是唯一选择。SYBR Green只适合单重反应。不过,SYBR Green的优势在于能监控qPCR反应的质量。你能够了解反应过程中发生的所有扩增,是否存在残留污染,是否有引物二聚体等等,这是探针型分析无法给予的。

顺便提一下,大家通常认为探针法更加特异,而SYBR Green更为经济,适合筛查多个目标。然而,专家却有不同的看法。Qiagen全球高级产品经理Annette Tietze认为:“SYBR Green检测是一种经济高效的方法,主要用于未知目标的筛查。而在科学家寻找一个有趣的目标时,他们倾向于转到探针型PCR,因为他们认为这更加特异。在Qiagen,我们比较了SYBR Green和探针型检测,发现通过这两种方法,我们能实现至少相同的特异性,因此无需转变。”

我能达到几重?

提高多重分析能力无疑是受欢迎的。许多厂家提供二重分析试剂,有些提供了五重试剂。安捷伦的MassCode PCR solution甚至支持25重分析,它融合了多重PCR和LC/MS技术。首先,开展多重PCR。每个引物都带有一个标签(tag),这样每个扩增子都有两个标签。随后纯化PCR产物,并将包含产物的96孔板置于自动上样器中,这样每个样品上样到LC/MS系统中,切除标签,并通过质谱仪检测。如果你们实验室没有质谱仪,而又想开展多重分析,那么下面的一些方案可能适合你。

罗氏应用科学部的Light Cycler 480 Probes Master Mix能成功支持4重反应,甚至达到5重。这是一种即用型的反应预混液,包含了FastStart Taq 热启动型DNA聚合酶,它能减少非特异产物的形成,从而显著改善PCR的特异性和灵敏度。

Bio-Rad的iQ Multiplex Powermix能检测最多4个目标,即使它们的表达量相差106倍,若表达量相当,则可以检测最多5个目标。若起始样品为cDNA,则线性范围可达6个数量级,若起始样品为基因组DNA,则线性范围达4个数量级。索取资料>>

QIAGEN也推出了多重分析试剂盒,能检测最多4个目标,如新的QuantiFast Multiplex PCR 和RT-PCR Kit,而现有的QuantiTect Multiplex Kit适合标准循环仪。据介绍,QuantiFast试剂盒适用于标准和快速的循环仪,兼容双标记的TaqMan探针,如QuantiFast Probe Assay。此外,QIAGEN还提供专门用于Rotor-Gene Q的 Rotor-Gene Multiplex PCR和RT-PCR Kit。所有这些试剂盒都是为基因表达分析设计的,能同时检测最多4个目标,用在两步法和一步法RT-qPCR中。这些试剂盒特别适合低丰度的转录本,能检测低至10个拷贝。索取资料>>

如何提高成功率

建立多重反应的步骤如下:1)优化引物和探针序列,2)选择标记探针的报告基因和淬灭基因,3)优化单重实验,4)验证多重实验,5)必要时,优化多重实验。在开始多重PCR前,需要记住几件事。

从简单开始 想要一步登天,那是不可能的。在多重反应之前应通过单重反应来鉴别你的目标。之后再进入多重形式,看看引物-探针组合是否起作用。如果你的引物-探针组合不太好,就别深入下去,开展3重或4重检测。建议使用商业付费软件如Beacon Designer来设计多重反应的引物和探针组合。

反应体积 另一个考虑是反应体积。有些起始材料有限或很昂贵,那么研究人员会将反应体积缩小,以节约样品。反应体积能缩到多小,而不干扰反应本身呢?大部分客户使用20 μl反应体系。有人也许会问,5 μl反应体积能获得相同的结果吗?体积少了4倍意味着试剂少了4倍。对于二重反应而言,这可能蛮有挑战性,因为那些试剂之间互相竞争,可能更快地消耗。另一个潜在的问题是热循环过程中的蒸发。

起始材料 还有一个考虑是起始材料的相对量,相似量的结果一般更好。现在的难题是可靠检测同一管中的高丰度和低丰度目标。PCR反应会优先扩增高丰度,易于扩增的目的片段,从而导致非特异产物或缺少预期产物。以高效率结合的引物利用更多的PCR反应成分,从而降低了其他PCR产物的产量。这常常导致某些DNA序列未被扩增,或缺少预期的PCR产物,最终导致假阳性或假阴性结果。

为此,QIAGEN提供了一种秘密武器,所有的多重PCR试剂盒都使用了一种特制的PCR缓冲液,它内含独特的添加剂MP因子。连同K+及其他阳离子,MP因子允许高效的引物退火和延伸,而与引物序列无关。MP因子提高了引物在DNA模板周围的局部浓度,并稳定了特异结合的引物。

Bio-Rad的qPCR预混液中也包含了专利的Sso7d融合蛋白技术,可帮助消除这个问题。Sso7d是一个小的双链DNA结合蛋白,能提高PCR聚合酶的速度、灵敏度和抑制剂耐受力,从而增强其性能。SsoFast Probes Supermix支持起始量相差一万倍的双重反应。

记住,当定量PCR走向多重,这可不是单重反应的简单叠加,我们还需要周密设计,反复优化,才能获得更好的结果。(生物通 余亮)

延伸阅读:

多重定量PCR的新突破和新应用

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