QIAGEN为您奉上miRNA研究解决方案[选购宝典]

小小的microRNA（以下简称miRNA）虽然只有~22个核苷酸，却发挥着举足轻重的基因调控作用。大量的证据表明，miRNA表达的失调是一些疾病过程的起因或指示剂，包括多种癌症。在癌基因与抑癌基因复杂的分子网络中，miRNA有着不可替代的地位。miRNA可通过抑制癌基因或肿瘤抑制基因表达，表现出肿瘤抑制基因或癌基因的作用。

前列腺癌是一种复杂的疾病。为了鉴定与浸润性前列腺癌相关的候选基因，美国明尼苏达大学的Liang Wang等开展了一项系统生物学研究，将差异表达分析与共表达网络分析结合起来，评估了前列腺癌患者的转录图谱。1 通过对62名具有浸润性表型和63名非浸润性表型的前列腺癌患者的研究，他们鉴定出7个显著差异的miRNA，结果表明，这些miRNA在胚系水平的差异表达可能使枢纽基因失调，导致异常的细胞分裂和增殖，最终形成前列腺癌的浸润性表型。

乳腺癌则是危害女性健康的主要恶性肿瘤，虽然50%的乳腺癌经手术治疗后可治愈，但仍有50%的病人在治疗后5年内出现复发转移。miRNA在乳腺癌侵袭转移过程中起着非常重要的作用。其中一部分miRNA对乳腺癌侵袭转移起促进作用，另外一些则起到抑制作用。其中miR-146就属于后者。美国阿拉巴马大学的Douglas Hurst通过研究表明，乳腺癌转移抑制基因1（BRMS1）上调了miR-146的表达。2 该研究结果进一步支持了最近的观念，即调节miR-146的水平有可能抑制乳腺癌的转移。

近年来，研究还发现，miRNA分子同已知的循环核酸（DNA和RNA）一样，广泛存在于正常人和不同种病人的血清和血浆中，并且随着生理状况、疾病的类型和病程的不同而表达异常。随着循环miRNA的发现，人们对miRNA的兴趣日增，这么好的疾病诊断和预防标志物，岂能错过？

既然miRNA如此有潜力，那么大家一定跃跃欲试，恨不得马上着手研究。如何开展miRNA研究呢？一般来说，通常是先开展miRNA表达谱分析，筛选出与特定生物学过程相关的miRNA。之后，miRNA的过表达和沉默，则是一种有力的功能分析方法。miRNA研究要想成功，当然也离不开高性能的工具和技术。QIAGEN公司向来以稳定可靠的产品质量著称，其miRNA产品也同样值得我们信赖。打开QIAGEN的GeneGlobe® 网页，您会发现它提供了miRNA纯化、定量和功能鉴定等各方面的产品，满足了您的一站式购物需求。

miRNA表达谱分析

miRNA的纯化自不必说，这本来就是QIAGEN的强项。在上面提到的乳腺癌研究中，Douglas Hurst等人就利用QIAGEN的多项工具，定量了miRNA的表达。2 他们首先利用Qiazol裂解了细胞，然后用miRNeasy系统纯化出总RNA。利用QIAGEN提供的miScript引物，他们定量了乳腺癌中miR-146的表达。

QIAGEN新一代的miScript PCR System实现了灵敏且特异的miRNA定量和图谱分析。它覆盖了miRNA定量的所有步骤，从RNA转化成cDNA，到miRNA的实时定量PCR检测，再到简明易懂的数据分析。

这其中有一个重磅武器，那就是miScript miRNA PCR Array。大家都知道，芯片是开展miRNA图谱分析的不错选择，但若是实验室没有成熟的芯片分析平台，通常要将实验外包，价格不菲。而有了miScript miRNA PCR Array，只需一台定量PCR仪，即可开展快速的miRNA表达谱分析。阵列中的每个assay都经过实验室验证，以确保成熟miRNA的灵敏特异检测。

整个分析过程很简单。首先，利用miScript II RT Kit和miScript HiSpec Buffer制备cDNA。其次，向miScript miRNA PCR Array中加入cDNA、miScript Universal Primer、QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和无RNase的水。之后，在实时定量PCR仪上运行反应。最后，利用网上免费的数据分析工具分析数据。

对付循环miRNA

自研究发现循环miRNA在肺癌、肠癌、前列腺癌、糖尿病、和药物性肝损伤等疾病中的显著意义以来，研究人员就一直致力于循环miRNA可否用于临床疾病的无创诊断的应用研究。对于此方面的研究，QIAGEN也提供了一系列工具。

在一项HIV易感性的研究中，美国费城儿童医院的Xu Wang等致力于了解miRNA表达与HIV-1易感性的关联。3 他们首先利用QIAGEN的miRNeasy Mini Kit从细胞中提取了总RNA，之后用miScript Reverse Transcription Kit进行了逆转录。通过miScript Primer Assays和miScript SYBR Green PCR Kit，他们对几个抗-HIV-1 miRNA（miRNA-28、miRNA-150、miRNA-223和 miRNA-382）进行了定量。结果表明，抗-HIV-1 miRNA介导的先天免疫可能在保护单核细胞/巨噬细胞免受HIV-1感染上起了关键作用。

此外，南京大学医药生物技术国家重点实验室的张辰宇教授研究组最近获得了一项重要成果 4。他们不仅在人类的血清和血浆中发现了稻米中富含的miRNA-MIR168a，而且推断，植物的miRNA可通过日常食物摄取的方式进入人体血液和组织器官。功能研究证实，MIR168a可以与人/小鼠的低密度脂蛋白受体衔接蛋白1（LDLRAP1）的mRNA结合，从而抑制其在肝脏中的表达，进而减缓小鼠血浆中低密度脂蛋白的清除。这证明了食物中的外源性植物miRNA可以调控哺乳动物体内靶基因的表达。

miRNA功能分析

若是在大规模图谱分析中发现了显著差异的miRNA，那么恭喜您，下一步可开展miRNA的功能验证了。miRNA的功能研究与基因相似，过表达和沉默是两种有力的方法。通过miRNA功能研究，您能够确定特定miRNA的目标和作用，分析单个miRNA失调的生物学意义。功能研究可利用miScript miRNA Mimic、miScript miRNA Inhibitor以及miScript Target Protector来开展。

• 利用miScript miRNA Mimic模拟内源miRNA的调控
• 利用miScript miRNA Inhibitor抑制内源miRNA
• 利用miScript Target Protector保护单个miRNA目标基因

miRNA模拟物

miScript miRNA Mimic是合成的双链RNA，它们转染到细胞之后，模拟了天然存在的miRNA。在转染72小时之后，基因表达被有效抑制。

在前面提到的前列腺癌研究中，Liang Wang等就利用了QIAGEN的双链miRNA mimics来研究miRNA的功能。1 他们发现，在7个差异表达的miRNA中，5个与细胞周期调控有关，而预计另2个（miR-145和miR-331-3p）靶定了20个枢纽基因中的3个。这两个miRNA的异位表达降低了目标枢纽基因的表达，随后导致细胞生长抑制和凋亡。

miRNA抑制剂

与miScript miRNA Mimic不同，miScript miRNA Inhibitor是经过化学修饰的单链RNA，它们在转染后抑制miRNA的功能。这些抑制剂经过设计和修饰，确保内源miRNA功能的高效抑制。时间进程实验表明，miScript miRNA Inhibitor在转染后至少96小时内有效。

选择性保护miRNA靶标

miScript Target Protector是经过修饰的单链RNA，它特异干扰miRNA与单个靶标的相互作用，而不影响同一miRNA对其他靶标的调控。在转染之后，miScript Target Protector与特异的miRNA结合位点结合，阻碍miRNA进入该位点，并防止基因下调。这时，可开展表型或基因表达分析。目标基因表达增加，信号模式的改变，或表型改变，都可提供线索，说明研究中的miRNA和靶标参与了您感兴趣的通路或表型。

有了以上这些成熟的研究工具，相信您的miRNA研究再也不用发愁了。若您对这些产品感兴趣，请点击此处索取进一步的资料。（生物通 余亮）

参考文献：
1. Liang Wang, Hui Tang, Venugopal Thayanithy, et al. Gene Networks and microRNAs Implicated in Aggressive Prostate Cancer. Cancer Res 2009;69:9490-9497.
2. Douglas R. Hurst, Mick D. Edmonds, Gary K. Scott, et al. Breast Cancer Metastasis Suppressor 1 Up-regulates miR-146, Which Suppresses Breast Cancer Metastasis. Cancer Res 2009;69:1279-1283.
3. Xu Wang, Li Ye, Wei Hou, Yu Zhou, et al. Cellular microRNA expression correlates with susceptibility of monocytes/macrophages to HIV-1 infection. Blood 2009 113: 671-674.
4. Lin Zhang, Dongxia Hou, Xi Chen, et al. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA. Cell Research 2011: 1-20