让miRNA表达谱分析触手可及[新品推荐]

MicroRNA（miRNA）是近年来广受关注的基因表达调控因子，在人类疾病的发生发展中起着重要作用。研究人员在多种人类肿瘤病例中发现多种miRNA表达异常--要么是成熟的miRNA，要么是前体miRNA，抑或二者皆有。作为一大类新型潜在的生物标志物，miRNA当然也成为研究的热点。

对于miRNA的定量，QIAGEN曾推出了一套miScript检测体系。它利用Real-time PCR，通过SYBR Green法来精确定量miRNA，简单快速。随着研究的深入，由于miRNA分子长度短而种类繁多，研究不同条件下的多个miRNA表达差异，逐渐成为一个挑战。近日，QIAGEN在miRNA表达谱分析上又推出最新力作。

与常规的miRNA表达谱芯片不同，miScript miRNA PCR Array更像是miRNA PCR Assay的集合。它凭借高的PCR扩增效率，将PCR的高灵敏度和高特异性引入miRNA检测中。于是，miRNA表达谱分析不再遥不可及，只要您的实验室拥有实时定量PCR仪，无论是ABI的仪器，还是Bio-Rad、Stratagene或罗氏的仪器，都能立即开展。

分析的过程很简单。首先，您需要准备好50 - 400 ng小RNA或0.5-4 μg总RNA，利用第一链试剂盒生成cDNA模板，再将cDNA模板与即用型PCR master mix混合。然后，将等体积的混合液分配到每个孔中，开展实时定量PCR运行。最后则是轻松的数据分析。其中特异检测miRNA的引物已经设计好，PCR master mix也是即用型的，都无需您劳力劳心。可别小看引物设计，它可是特异检测miRNA的关键。因miRNA序列很短，且很多只有单个核苷酸差异，若不借助特异的引物，根本就无法区分。

高特异性
对于miRNA分析来说，大家往往最关心的就是特异性。miRNA不仅长度很短，而且序列高度相似，这就为特异检测带来了挑战。miScript miRNA PCR Array中专利的引物设计能够区分仅有单个核苷酸错配的miRNA家族成员，特异性极佳（详见下表）。

合成的miRNA  模板	分析引物	相对检测 (%Perfect Match)	miRNA模板序列
miR-10a	miR-10a	100.00	UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG
	miR-10b	0.98
miR-10b	miR-10b	100.00	UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG
	miR-10a	0.01

高灵敏度
对于成熟miRNA和前体miRNA，miScript miRNA PCR Array也能准确分辨。miScript II RT Kit优先逆转录成熟miRNA，从而降低了非特异性背景，并增加灵敏度。miScript Primer Assay在灵敏度方面比其他分析高了三个数量级（下图）。此外，miScript miRNA PCR Array还有着宽的线性动态范围。对于10 pg-400 ng的小RNA，或100-1010个拷贝的miRNA cDNA模板，分析都呈现出线性。

高重复性
miScript miRNA PCR Array还表现出高度的重复性，其相关系数R2 > 0.99。这种重复性水平意味着不同循环运行、阵列、平板及样品之间的结果可放心比较。利用miRNome miScript miRNA PCR Array，在ABI 7900HT上鉴定来自人脑组织的小RNA重复样品，结果如下图。

精心设计的布局和对照
miRNA PCR Array有96孔和384孔板两种形式，能检测88或376个miRNA序列的表达。每个阵列中还包含了看家序列及其他对照，用于数据标准化，并了解RNA质量和PCR性能。

至于芯片上的内容，也是大家非常关心的。我研究的是发育，他研究的是癌症，有没有各种应用特异的芯片呢？答案当然是肯定的。QIAGEN除了推出人、小鼠和大鼠的全基因组芯片，还推出了多种focused miRNA Array，包括癌症、细胞分化&发育、炎症、神经发育&疾病等，为研究人员带来了更多的选择。下面几个有代表性的结果阐明了利用miScript miRNA PCR Array可开展的实验。

癌症研究：发现miRNA癌症标志物

miScript Human Caner Pathway Finder PCR Array鉴定出潜在的结肠癌生物标志物。在结肠癌中，许多miRNA序列上调。从人结肠肿瘤及匹配的邻近正常组织中分离出小RNA，并利用针对88个癌症相关miRNA的PCR Array来鉴定。通过ΔΔCt方法以及看家核小RNA标准化的原始数据计算出每个miRNA的倍数差异（下图）。

细胞分化 & 发育：鉴定出可能调控成骨作用的miRNA

人脂肪组织来源的间充质干细胞在正常或成骨分化培养基中培养16天，之后进行miRNA序列的相对表达谱分析。通过散点图中未分化（X轴）和分化（Y轴）细胞的比较，计算出标准化的miRNA表达水平（下图）。白色区域外的符号代表了在成骨分化中至少有2倍表达差异的miRNA。

信号转导研究：筛选出p53响应性的miRNA

miRNome miScript miRNA PCR Array还能鉴定出对p53过表达作出响应的已知或新颖miRNA序列。芯片鉴定出已知的p53靶点-mir-34a和mir-34c，以及多个新的候选靶点，包括mir-203、mir-551a、mir-940、mir-614及其他。

用编码p53或含有空载的腺病毒转导PC3细胞。48小时后，用包含376个人miRNA特异分析的PCR Array鉴定小RNA。热图显示出p53过表达后miRNA表达的倍数差异（下图，红色，上调miRNA；绿色，下调miRNA；黑色，无差异）。

有了这些鲜活的案例，您是不是也跃跃欲试，准备在实验室中大展拳脚呢？若您在实验室还无法或无暇开展miRNA分析，也可以将样品寄给QIAGEN，享受他们的基因表达分析服务。如欲了解产品或服务的更多信息，请点击此处。

（生物通 余亮）