使用ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统分析抗体-膜结合蛋白以及蛋白-脂类物质间的相互作用[创新技巧]

ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统基于表面等离子体共振（SPR）技术，可同步测定36种生物分子间的相互作用。本文就是利用其研究人工膜和两种重要的多肽。我们还描述了如何使用ProteOn NLC芯片来捕获生物素标记的和非生物素标记的膜蛋白脂质体，并展示了嵌入脂膜中的蛋白和各自抗体的，呈明显剂量-效应关系的相互作用曲线。

介绍：
研究细胞膜、膜结合蛋白和抗体间的相互作用以及这些作用的互相影响是药物研发中非常值得关注的事情。膜蛋白和膜相关蛋白以及多肽类物质在很多生物过程中的地位都非常重要，同时还参与到一些诸如癌症等疾病的关键信号通路中。因此，膜蛋白正迅速成为下一代药物靶点分子大类。

ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统基于表面等离子体共振（SPR）技术，可同步测定36种生物分子间的相互作用。本文就是利用其研究人工膜和两种重要的多肽。Amyloid beta （A）肽在阿尔茨海默病的病理改变中起重要作用，而-synuclein肽则存在于帕金森病的病理变化中。通过一张修饰过的ProteOn传感芯片，我们将Ab与人工膜的结合动力学数据给测定出来。我们还描述了如何使用ProteOn NLC芯片来捕获生物素标记的和非生物素标记的膜蛋白脂质体，并展示了嵌入脂膜中的蛋白和各自抗体的，呈明显剂量-效应关系的相互作用曲线。点击索取更多技术资料

 
图1. ProteOn XPR36 系统配基-分析物结合分析的6 × 6阵列格式。A) 6个ligand 被偶联到6条平行的纵向通道中（蓝色）；B) 6个analyte注入到6条与之前相垂直的通道中（黄色）；C) 单个ligand–analyte互作位点 (绿色区域)以及2个位点间参照（黄色）。

实验1. 使用单层小泡（SUVs）对GLM芯片进行修饰并捕获A和-Synuclein多肽

芯片修饰
传感芯片表面用50 mM NaOH和8 mM CHAPS分别在横向和纵向两个方向冲洗两遍，然后纵向连续注入3针PBS，流速设为100 µl/min。通道1、3和5用0.05 M sulfo-NHS和0.02 M EDAC活化，条件为30 µl/min，6分钟。将5 µl Undecylamine（十一胺）和495 l DMSO（二甲基亚砜）混合后用pH 5.0的醋酸钠溶液稀释20倍。混合液用移液器吹打混匀，直至澄清。Undecylamine (0.05% v/v) 以30µl/min，注入到通道1、3和5，持续6分钟。最后将通道1、3和5用1M 盐酸乙醇胺去活化，条件是30 µl/min，6分钟。随后芯片表面用50 mM NaOH纵向流过芯片以稳定基线。

脂质捕获
单层小泡（SUV）的制备是参照前人文献 (Smith et al., 2008)，然后用PBS稀释到终浓度0.4 mM。SUV在30 µl/min的流速下纵向注入芯片400s。1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- [phospho-L-choline] (POPC) (0.4 mg/ml)注入通道1和2。1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero- 3-[phospho-L-serine] (POPS)注入通道3和4。通道5和6流过POPC和POPS的混合物。

Analyte注入
A 蛋白(100 µg)按照已有文献的描述的制备成终浓度22 µM的PBS溶液。芯片表面用PBS以100 µl/min横向注入30秒冲洗。冲洗3-4次后A (8.8 µM)或-synuclein (7 µM)以100 µl/min横向注入，结合1分钟，解离10分钟。测定动力学数据时，A蛋白以一系列浓度 (11 µM, 5.5 µM, 2.75 µM, and 1.375 µM) 注入4个通道，仅留一个通道注入缓冲液。

芯片表面再生
芯片再生需要去掉脂质，用50 mM NaOH和8mM CHAPS依次注入芯片，采用短时脉冲形式，即100 µl/min的流速，18秒。

 
图2. 将特定的脂质 POPC, POPS, 和 POPC/POPS 捕获在Undecylamine处理过的GLM 传感芯片表面。

图3. A 蛋白有选择性地结合到用Undecylamine 处理过，并偶联了脂质POPC, POPS, or POPC/POPS的通道中；A 蛋白不会被捕获到未经处理的芯片表面。

图4. -synuclein蛋白有选择性地结合到用Undecylamine 处理过，并偶联了脂质POPC, POPS, or POPC/POPS的通道中；-synuclein不会被捕获到未经处理的芯片表面。

图5. A蛋白和OPC/POPS处理过的表面的浓度依赖性结合曲线。动力学数据来自3次结合实验的平均值：ka = 8.5 (± 0.3 ) x 103 M-1s-1; kd = 3.3 (± 0.1) x 10-3 s-1; KD = 407 (± 9) nM。

图6. 芯片再生后，将脂质POPC, POPS, 和POPC/POPS再次捕到undecylamine处理过的GLM 传感芯片上。通道1，3和5的再生用50 mM NaOH和8mM CHAPS依次注入。实线代表第一次脂质捕获曲线，虚线表示第二次捕获。点线代表脂质注入到未处理过的芯片通道2，4和6。

实验2. 生物素修饰的脂质体捕获到NLC芯片表面 

脂质结合
将含单纯疱疹病毒标签的M2肽的低生物素化二肉豆蔻酰磷脂酰（DMPC）胆碱脂质体（以色列Weizmann 研究所Shai Arkin 教授惠赠）用缓冲液（PBS）稀释2倍，然后以25 l/min流速注入垂直方向的1通道，注入2次，共60 l。作为对照，将不含HSV-M2肽的生物素化的脂质体和非生物素化的脂质体分别注入水平方向的2和3通道。

Analyte注入
将120l 333nM的抗HSV抗体以100l /min流速注入水平通道。
再生
以100l /min流速注入20mM CHAPS，注入1.2分钟去除脂质体和抗体。后续分析实验可重新偶联脂质体和抗体。
 

图7. 生物素化脂质体捕获到NLC芯片表面。通道1（蓝色曲线），整合HSV-M2肽的生物素化脂质体；通道2（粉色曲线），不含HSV-M2肽的非生物素化脂质体（无结合）；通道3（浅蓝色曲线），不含HSV-M2肽的生物素化脂质体（无结合）。

图8 捕获到NLC芯片表面的含HSV-M2肽的生物素化脂质体与抗HSV抗体的相互作用。左图，通道中抗HSV抗体与脂质体结合的原始图线。通道1（蓝色曲线），整合HSV-M2肽的生物素化脂质体；通道2（粉色曲线），不含HSV-M2肽的非生物素化脂质体（无结合）；通道3（浅蓝色曲线），不含HSV-M2肽的生物素化脂质体（无结合）。右图，抗HSV抗体与整合HSV-M2肽的生物素化脂质体的特异性反应（以通道2为参照通道）。

图9. 脂质体再生和重新捕获。

实验3. 在修饰过的NLC芯片表面捕获非生物素化的脂质体

脂质的结合
为了避免使用囊泡，将生物素化的双棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)加入到含有10% DMSO的运行缓冲液中，在垂直方向上以25 l/min的流速注射180 l到通道1和通道2，将含有HSV-M2多肽的非生物素化的脂质体以25 l/min的流速注射100 l到通道1，通道2作为空白参照。

Analyte的注入
抗HSV的抗体分别以10, 5, 和2.5 nM三个浓度，100 μl/min的流速，水平注射250μl。

再生
将20 mM Tween 20或20 mM CHAPS以25 μl/min的流速注射30 μl可以除去脂质体和抗体。再生后，按照上述方法重复注射过程，可将脂质体重新捕获到NLC芯片表面。
 

图10.  抗HSV的抗体(10, 5, 和2.5 nM)与嵌入到NLC芯片表面脂质体中的HSV-M2多肽的相互作用。

结论
• ProteOn XPR36蛋白相互作用系统提供了操作简便、低成本的方法，便于研究膜-蛋白之间和膜蛋白-抗体之间的相互作用。
• 这些相互作用能通过ProteOn 系统的6*6阵列采用高通量的方式进行测定。
• 源于 POPC 和 POPS 的单层小泡（SUV）能够被反复地捕获到修饰过的ProteOn GLC芯片上，Aβ 多肽和 α-synuclein 多肽的结合程度亦能测定。
• 能测定Aβ 多肽与芯片上捕获的POPC/POPS SUV 表面的结合动力学。
• 含有HSV标签的 M2 多肽的脂质体，不管是生物素化与否，都可以反复结合到ProteOn NLC芯片上，重复性很好。
• 抗HSV标签的抗体和嵌入到脂质体中的M2多肽的相互作用也能被检测到。
• ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统是个强大的工具，可以用于研究膜和膜相关蛋白、多肽、抗体的相互作用。

参考文献
Smith DP et al. (2008). Formation of a high affinity lipid-binding intermediate during the early aggregation phase of alpha-synuclein. Biochemistry 47 (5), 1425–1434.
Tew DJ et al. (2008). Stabilization of neurotoxic soluble beta-sheet-rich conformations of the Alzheimer’s disease amyloid-beta peptide. Biophys J 94 (7), 2752–2766.