五花八门的DNA甲基化检测（下）[创新技巧]

近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析（methylation profiling）。下面生物通给大家介绍一些常用的方法。

全基因组的甲基化分析

基于芯片的甲基化图谱分析

就甲基化图谱分析而言，目前流行的分析方法是芯片。多个公司都提供了这种工具，包括安捷伦的Human CpG Island Microarray Kit，Illumina的HumanMethylation27 DNA analysis BeadChip，Roche NimbleGen的Human DNA Meth 2.1M Deluxe Promoter Array和Affymetrix的seven-array GeneChip® Human Tiling 2.0R Array Set。

平台不同，过程也各异。安捷伦和NimbleGen的分析过程中，基因组DNA分成两份，一份用来做MeDIP，另一份作为对照。两个样品都标记荧光（富集的样品用Cy5标记，对照用Cy3标记），然后与芯片杂交。芯片上每个探针的Cy5/Cy3强度比例显示出该区域的甲基化程度。

安捷伦的244,000-element array覆盖了27000多个人CpG岛和甲基化不足区域（UMR）。NimbleGen的Human 2.1M Deluxe Promoter array也覆盖了27000多个CpG岛，还包括了27000多个启动子区域，所有这些都是以100 bp的分辨率。然而这两个平台都不能以单核苷酸的分辨率报告甲基化状态，但是Illumina的Infinium和GoldenGate分析做得到。

Illumina的Infinium HumanMethylation27 BeadChip芯片覆盖27,578个CpG位点。分析利用两个位点特异的探针拷问这些化学上差异的位点，一个探针是为甲基化位点（M磁珠类型）设计的，而另一个是为未甲基化位点（U磁珠类型）设计的。探针的单碱基延伸掺入了一个标记的ddNTP，它随后被荧光试剂染色。通过计算甲基化与未甲基化位点的荧光信号比例，可确定拷问位点的甲基化水平。

此产品虽评价颇高，可惜目前已停产，取而代之的是Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片。它以单碱基分辨率覆盖了每个样品中超过45万个甲基化位点，实现了基因区域和CpG岛的全面覆盖。此外，还附加了甲基化专家所精选的高价值内容，包括CpG岛之外的CpG位点，在人类干细胞中鉴定出的非CpG甲基化位点，以及肿瘤和正常组织中差异表达的甲基化位点等等。它的高覆盖度、高通量以及低价格，让它成为筛选GWAS群体的理想选择。索取HumanMethylation450 BeadChip芯片的更多资料

相比之下，VeraCode GoldenGate甲基化分析更适合高通量的验证研究，它以溶液的形式分析48至384个用户指定的CpG位点。首先，将亚硫酸氢盐处理的基因组DNA与分析oligo混合，oligo与未甲基化位点的U互补，或者与甲基化位点的C互补。杂交之后，引物延伸，并连接上位点特异的oligo来产生通用PCR的模板。最后，用标记的PCR引物生成可检测的产物。据Illumina的产品专家介绍，其产品的最大优势在于单个CpG位点的分辨率。其它分析将甲基化定位在一段区域，而通过Illumina分析，你能精确测定某个CpG位点的甲基化水平。索取GoldenGate甲基化分析的更多资料

高通量测序

新一代测序仪的飞速发展，使得测序成本大幅度下降，也使得甲基化组（methylome）的研究成为可能。近两年，多个研究小组将传统的甲基化工具（如DNA的亚硫酸氢盐转化）与目标基因组捕获技术和高通量测序相结合，绘制出了多张甲基化图谱。

而第三代测序技术的出现，更是让甲基化的直接测定成为可能。一年前，美国Pacific Biosciences公司利用独有的单分子实时（SMRT）测序技术，直接测定了DNA的甲基化。这项成果发表在《Nature Methods》杂志上。

SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲，依据其颜色鉴定出核苷酸。当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时，脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息，从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。

研究人员使用这些动力学特征，鉴定出基因组样品中的腺嘌呤甲基化，并发现再结合circular consensus sequencing，他们能够在单碱基分辨率上鉴定出表观遗传学修饰（mA、mC和hmC）。

飞行质谱

美国Sequenom公司的MassARRAY® 平台也可用于DNA甲基化分析。MassARRAY® EpiTYPER™ DNA 甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应和 MALDI-TOF 检测原理，可实现多重CpG的分析检测。

碱基特异性酶切（MassCLEAVE）实验由亚硫酸氢盐处理待测 DNA 开始。经过亚硫酸氢盐处理，DNA中未甲基化的胞嘧啶 (C) 转变为尿嘧啶（U），由此在DNA模板中产生甲基化特异的序列变化。利用 5' 末端带有T7-启动子的引物进行 PCR 扩增，产物经 SAP (虾碱性磷酸酶)处理后用于碱基特异性的酶切反应。酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化，飞行质谱能测出每个片段的分子量，配套软件 EpiTYPER 则能自动报告每个相应片段的甲基化程度。

MassARRAY甲基化检测无需任何荧光标记，每个反应覆盖长达500 bp的多个CpG位点，且灵敏度高，可检测低至5%的甲基化水平。目前有多家公司提供MassARRAY甲基化检测服务，如北京毅新兴业。点击了解更多信息

此外，科学家们也开发出一系列的技术和工具，在全基因组范围定位DNA甲基化，生物通将在后文中继续报道，敬请留意。