454测序技术对艾滋病感染者干燥血斑中病毒进行抗药性检测[创新技巧]

加拿大公共卫生局的研究人员利用二代测序技术对血斑中的艾滋病病毒基因进行测序，低成本地检测HIV病毒抗药性。此方法比基于PCR的对血浆样品进行基因分型的成本更低，还可以更全面地了解艾滋病毒抗药性信息。

来自Genomeweb的消息，加拿大公共卫生局的研究人员利用二代测序技术对血斑中艾滋病病毒基因进行测序，低成本地检测HIV病毒抗药性。此方法比基于PCR的对血浆样品进行基因分型的成本更低，还可以更全面地了解艾滋病毒抗药性信息。

一项发表于Antiviral Therapy杂志的初步研究中，加拿大国家艾滋病病毒及反转录病毒实验室利用罗氏454 GS FLX系统对48位感染HIV-1病毒病人的血斑进行测序，研究病毒的抗药性。这些样本来自在2007年进行的一项研究，这些病人被诊断感染HIV-1，但尚未接受任何治疗。

这次研究主要是为了确定是否能够利用二代测序技术从已经干燥的血斑中，鉴定抗药性病毒株，并且降低其检测成本。实验中使用GS FLX系统进行测序，并将结果与Sanger方法进行比较。研究人员将样本进行序列标记并混合后在GS FLX上测序，获得3个相互重叠的扩增子序列，覆盖了整个HIV-1 PR基因以及RT基因的前237个编码子。

结果发现，454测序结果与Sanger方法相符，甚至检测到一个Sanger法没有检测到的突变。文章的作者说道：“混合样本的454焦磷酸测序是一个非常有效而经济的二代测序方法，尤其应用于干血斑的HIV病毒抗药性发生率鉴定。这一方法有助于在有限的资源及配置下，低成本高通量地获得HIV病毒抗药性数据。”

加拿大卫生局HIV遗传学实验室主任James Brooks认为将血斑用于检测相比血液有诸多优势，比如更容易进行收集储存。收集血液样本需要止血带，针头，符合标准诊所设置并从血液中分离细胞成分。而血斑只需要抽取很少的血液，在纸上进行干燥保存。除此之外，血液需要保存在零下八十度，这一条件对于许多实验室是一个挑战，而血斑可更简单而长期的保存。

同时，他表示这次基因分型的实验表明，对未接受治疗的艾滋病患者的血液和血斑的检测结果有很好的一致性，为下一步寻找低成本的病毒抗药性筛选方法奠定了基础。这一技术有望将原有实验基因分型价格和商业测试价格分别降低40%和90%。

Brooks说，“虽然454的测序技术相对于其他二代测序系统价格略高，但是454的长度长特点非常适合我们所关注的HIV基因组的区段。而Ion Torrent的技术也有一定的特长，但是目前它的读长还不够长。所以这次454成为了赢家。”

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除了更加便宜之外，比起传统方法二代测序方法可以更灵敏的发现变异基因。在初步研究中，即使在出现频率大于20%的变异中，454发现了一个Sanger测序没有发现的变异（其频率约为20.4%）。如果测序深度进一步增加，二代测序可以发现频率在1%的变异。研究人员下一步将决定测序深度，主要因素在于低频率变异的临床意义及重要性。Brooks说，“要决定测序深度并不容易，因为有证据表明一些低频率的突变也导致抗药性，而低频率突变在人群中出现的几率很小。”测序的深度也是影响检测价格的因素之一。目前对于一些低频率突变引起部分患者抗药性的原因还不明确。

对于临床来说，另外一个关键步骤是如何自动化这项检测。从样本制备到生物信息流程的建立，实验小组正与加拿大微生物实验室合作开发相关软件。此外，对于已接受治疗的患者，采取血斑是否合理还需进一步论证，因为在接受治疗之后所采集的血斑中的病毒和血液中的病毒可能不同。

实验室的最终目标是建立一个从焦磷酸测序到直接产生抗药性报告的一体化检测方案。这一技术将推广到加拿大以外的其他国家。比如世界卫生组织HIV病毒抗药性实验室网络中的其他实验室。Brooks所在的实验室也接受来自其他国家的样本，通常是一些中低收入国家，实验室赞助所有的检测费用，一旦实验成本可以有效降低，那么就可以提高更多的服务。

除此之外，这一技术也有望推广到其他疾病比如肝炎。目前加拿大卫生局已经着手用该方法对于丙肝病人的血斑中的病毒进行分型，以监测丙型肝炎的发展趋势，这一技术无疑对于降低基因分型成本有极大帮助。

关于454
454是第一家新一代测序技术的缔造者，基于焦磷酸测序的基本原理，将其优化为迄今为止可达1Kbp单一序列读长的测序平台，以其长序列读长测序保持着在领域内无法替代的应用地位；2007年位于美国Branford 的454公司被罗氏收购，整合至罗氏诊断应用科学部，成为其最重要的产品线之一，为探索新一代测序技术在人类健康事业中的应用而奋力前行。

原文链接：

454 Sequencing from Dried Blood Spots Could Help Monitor HIV Drug Resistance