独立研究证实V3 western流程的优越性[创新技巧]

生物通报道 来自澳大利亚弗林德斯大学（Flinders University）的研究人员近日在《Analytical Biochemistry》杂志上发表独立研究成果，证实了在western blotting中采用Bio-Rad stain-free技术的优越性。

弗林德斯大学的Alex Colella博士及其同事在文章中介绍了stain-free（无染色）方法让他们可评估电泳和western转移的质量，之后再开展western blotting的后续步骤，这样能够在更短的时间和更少的步骤内获得更准确的blot数据。

为了确保半定量western blotting的准确性，最重要的步骤之一是确定每块凝胶的蛋白上样量。蛋白估算不精确、移液不准确，或蛋白转移不均匀，都可导致上样误差。一般来说，研究人员依靠两种上样对照：用看家蛋白（β-actin）的抗体重新标记，或使用总蛋白染料，如SYPRO Ruby、丽春红或考马斯蓝。

在使用看家蛋白作为上样对照时，必须确定实验变量改变时，这个蛋白的表达水平不变。在某些情况下，与待测蛋白相比，看家蛋白的表达量有可能过高或过低；有时，在比较不同组织提取物中的特定蛋白丰度时，这些对照甚至不可用。

Chataway博士及其同事利用来自大鼠视网膜的未纯化蛋白（10-40 µg）开展了一系列western blot。他们利用Bio-Rad的V3 western流程进行电泳分离、印迹转移和观察。V3 western流程是Bio-Rad针对western blot推出的一系列产品，详见生物通之前的介绍《Western不仅要快，更要可靠》。

Stain-Free技术可实现蛋白分离和转移效果的实时观察。将跑完的预制胶或转印好的PVDF/NC膜放入ChemiDoc™ MP成像仪中，只需1分钟，即可对蛋白分离和转印情况了如指掌。他们的研究结果表明，stain-free方法是现有方法的出色替代，因为电泳和western转移的质量可在抗体检测之前证实。发现每一步中的问题有利于研究人员开展troubleshooting。同时，研究人员有更多的时间来优化他们的流程，因为stain-free方法将整个流程从2天缩短至1天。

Chataway博士提到stain-free凝胶和SYPRO Ruby染色的表现相当，但stain-free凝胶的使用让半定量western blotting的时间缩短了1.5小时。同时，由于避免了昂贵试剂的使用，stain-free方法也降低了总成本。

欢迎索取V3 western流程的更多资料！

弗林德斯大学医学院蛋白质组实验室的主管Tim Chataway认为：“我们的研究表明，Bio-Rad的stain-free凝胶可改善半定量western blotting实验的数据质量。”而Chataway博士也表示：“我们发现stain-free技术是传统方法的更快更经济高效替代，比对照上样这种方法更为出色。”（生物通 薄荷）

原文检索

Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology

Abstract

Loading controls are necessary for semiquantitative Western blotting to compensate for loading errors. Loading control methods include the reprobing of membranes with an antibody against a constitutively expressed protein or staining the membrane with a total protein stain. We compared the loading control performance of recently released Stain-Free (SF) gels with Sypro Ruby (SR) and reprobing using β-actin. SF gels demonstrated superior performance in that they were faster, required fewer steps and consumables, and allowed the quality of electrophoresis and Western transfer to be assessed before committing to costly and time-consuming Western blots.