生工精选：基于PCR方法的基因序列全长获取策略

　　

生物通报道：在最新一期《中国生物工程杂志》上，来自吉林农业大学动物科技学院的研究人员发表了题为“基于PCR方法的基因序列全长获取策略”的文章，介绍了基于PCR方法的基因序列全长获取方法，这将有助于基因结构、功能及其表达产物特性的研究。

高通量DNA测序技术的建立与发展为基因组数据库的建立与研究奠定了基础，但是作为一种补充，通过酵母双杂交、抑制性消减杂交、基因芯片技术、噬菌体表面展示等分子生物学和生物信息学技术进行特定性状目标基因的鉴定和分析，同样具有重要意义。利用这些技术筛选得到的部分基因序列获得目标基因的全长序列，为目标基因生物学功能的进一步研究和应用奠定了前期基础。

对于基因组测序已经完成的少数物种来说，可以轻松地从数据库中找到已知序列的侧翼序列，但是这只是研究少数模式生物的情况。而对于自然界中种类繁多的其他生物而言，基于PCR技术建立的多种染色体步移方法和cDNA末端快速扩增技术实现了通过已知片段快速获取未知基因序列的研究目标。依据原理，该方法可分为反向PCR 、 外源接头介导PCR和随机引物PCR三类。各类技术各有优缺点，且应用的主要领域和潜力各有差别。

文章介绍了反向PCR，外源接头介导PCR，随机引物PCR的各方面情况，指出，虽然早期建立的反向PCR连接效率较低，易产生较高的非特异性扩增，但简单快捷的特点使其在鉴定T-DNA插入位点、基因融合位点等方面应用较多，外源接头介导PCR则因特异性的提高而备受欢迎，并衍生出单特异引物PCR、捕获PCR和步降PCR等多种技术，取得了较理想的扩增效果。

而在大量样品分析中，自动化程度较高的随机引物PCR则更具优势。随着功能强大的聚合酶、连接酶、反转录酶的发现，推动了各种基于PCR的基因序列全长获取策略的发展，很多策略也因此而得以改进和整合，并获取更理想的实验结果，为研究基因结构、功能及其表达产物特性的研究提供了更完整的信息。

文章最后也指出了这些PCR方法的一些局限性，比如I-PCR必须借助于特异引物和环化处理，具有一定的特异性，外源接头介导PCR虽拥有较高的特异性和类似I-PCR的实用性， 但步骤较为繁琐。两种方法都要进行酶切消化， 对限制性内切核酸酶产品有一定的选择要求， 对样品数量及质量也有较高要求。

而TAIL-PCR虽然采用了不适合于高度重复序列分析的随机引物，但与多对特异引物组合，通过巢式扩增和温度筛选提高了反应特异性，同时，其自动化程度较高， 在对大量样品及转座子等大量插入位点侧翼序列分析时，该方法显示了非常优越的特点。

RACE技术在cDNA全长序列获取上具有快速有效特点，但由于poly(T)或poly(G)引物的应用，特异性受到影响。

随着不同方法的相互结合与渗透， 优势互补， 将会促使完整基因组序列的快速高效获取， 并逐步提高其特异性。TAIL-PCR有效减少了非特异性扩增，PEETA法不但有效地克服了“CpG岛” 的不良影响，也提高了特异性。如果两者结合使用， 相信可以获得更理想的结果。而将染色体步移的特异性和高效性与RACE的简单快速结合起来将会建立起新的更高效的RACE技术， 更好地服务于科研。

原文检索：

李昆鹏, 朱化彬, 郝海生, 赵学明, 冯荣, 秦彤, 张林波, 王栋,基于PCR方法的基因序列全长获取策略，中国生物工程杂志 2012.11 Vol 32, No.11.