支原体常用检测方法

【字体: 时间:2012年12月04日 来源:生物通

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  支原体感染会在你不经意时令培养细胞慢慢枯萎,因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。支原体感染不易察觉,只有在其扩散前找出被污染的培养物,才能及时避免更大的损失。本文就为你介绍了几种细胞培养中检测支原体的常用方法。

生物通报道:支原体这种微小的微生物(直径0.2-0.8 µm),是细胞培养中令人头疼的大问题。支原体污染可能来自培养基、血清或实验操作者,会影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。支原体感染不易察觉,因此对培养细胞定期进行支原体检测就非常重要。

污染实验室培养细胞的支原体主要有八种,但还没有哪种检测方法能够单枪匹马把这八种支原体都检测出来。支原体非常顽强,通常用于细胞培养的绝大多数抗生素都对其无效。例如青霉素主要作用于细菌细胞壁,但支原体没有细胞壁因此就不受影响。无懈可击的细胞培养技术始终是预防支原体感染的最佳方式,另外及时找出受到支原体感染的培养物也很重要,这样才能在感染扩散前快速采取有效措施。本文就为你介绍了几种在培养细胞中检测支原体的常用方法。

分离培养法

分离培养法是支原体检测的金标方法,其检测精确度最高。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样,并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体,它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长,最终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果,因此被誉为支原体检测金标准。不过分离培养法也存在两个弊端,一是检测时间太长,支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。二是尽管可以检测绝大多数支原体种类,分离培养法也有力所不及的时候,例如支原体M. hyorhinis

如果你实在不想等这么久,或者希望在分离培养法的等待过程中先拿到初步结果,你可以试一试DNAPCR或酶学检测方法。不过需要注意的是,上述检测方法都不能单独检出所有类型的支原体,而且灵敏度也没有分离培养法高,所以最好结合使用两种方法以获得最可靠的检测结果。

DNA检测

DNA检测需要将可疑样品与指示细胞共同培养,因此一般需要几天时间。DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞,如果原样本中含有支原体,那么当细胞DNA被荧光染料(如Hoechst染料)染色时,就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。分离培养法用来检测支原体M. hyorhinis菌株并不可靠,而DNA法可以准确的将其检测出来。

PCR

PCR法也可以检测M. hyorhinis菌株,PCR法检测支原体只需几个小时,是最快但也是最不灵敏的支原体检测方法。该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本,其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因。在凝胶电泳过程中,支原体DNA会显示为特异性条带,以此指示支原体的存在。PCR法可以检测大多数支原体,但谨慎起见最好同时使用另一种检测方法来进行验证。

酶学检测和ELISA

此外,也还存在一些其他支原体检测方法。例如酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中,在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP,随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以指示支原体的存在。ELISA也能用于支原体检测,以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体,来检测培养物中是否含有支原体。

定期检测

支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎,因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每13个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去,是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。

 

Caitlin Smith撰写/叶予编译)

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