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基于细胞的通路信号活性分析[新品推荐]

阐释基因功能以及确定蛋白、肽段、配体及小分子化合物作用机制的宝贵工具

【字体: 时间:2012年06月14日 来源:生物通

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  QIAGEN近期推出了信号通路分析工具Cignal™ Reporter System。这一产品线利用经过改造的转录因子报告基因,可准确、灵敏且定量地测定信号通路的激活。它是阐释基因功能以及确定蛋白、肽段、配体及小分子化合物作用机制的宝贵工具。

转录因子通过与基因上游启动子区中特异的DNA序列发生相互作用,来决定被调控基因的开启和关闭以及表达量。它们在调控基因表达、协调多个细胞过程中发挥着核心作用,也与多种人类疾病(如肿瘤和炎症)相关。转录因子的活性可作为细胞内信号转导通路状态的读数。因此,在功能基因组学和遗传学研究中,我们需要一种关键技术,来快速高效地测定转录因子的活性。

为此,QIAGEN推出了信号通路分析工具Cignal™ Reporter System。这一产品线利用经过改造的转录因子报告基因,可准确、灵敏且定量地测定信号通路的激活。它是阐释基因功能以及确定蛋白、肽段、配体及小分子化合物作用机制的宝贵工具。

此系统依靠双萤光素酶报告载体技术,实现了高的灵敏度和宽的动态范围。萤火虫萤光素酶报告载体包含特异的转录因子结合位点和基本启动子元件,它们驱动萤光素酶基因的表达。当信号转导通路被调控时,相关的下游转录因子的活性改变,而萤光素酶的表达水平也发生改变。萤光素酶表达的升高或降低将表现为发光强度的变化。

为什么使用双萤光素酶系统,而不是传统的单萤光素酶呢?那是因为单萤光素酶系统无法区分究竟是特定转录事件引起了萤光素酶表达改变,还是整体或技术差异引起了改变。于是,Cignal Reporter Assay采用双萤光素酶报告基因技术,克服了这一挑战。这一技术同时测定每个细胞中2种不同的萤光素酶——萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶。每个萤光素酶只与各自的底物发生反应。因此,萤火虫萤光素酶可作为实验报告基因,其活性与专门设计的实验条件的影响相关。而组成型表达的海肾萤光素酶则作为一个内对照,可实现各孔之间、各平板之间在细胞毒性、转染效率、技术变化和脱靶效应上差异的标准化,从而带来准确的结果。

经过如此周密的设计,Cignal Reporter Assay Kit可将异常转录和背景活性降至最低。同时,它们能够高度特异且灵敏地测定转录变化,信噪比高。利用这些分析,我们能够可靠地监控信号活性的上调和下调。此试剂盒还有一个优势,即采用立即可转染的载体,这带来了可靠性和便利性。拿到试剂盒之后,我们可立即开展实验,而不是花费大量时间来构建载体和挑克隆。

针对不同的通路和转录因子,QIAGEN提供了45种双萤光素酶形式的Cignal Reporter Assay。除此之外,针对NFkB、SMAD、AP-1等多个转录因子,它还提供了GFP形式的Cignal Reporter Assay。这两种分析形式有何不同呢,请看图1。

• 双萤光素酶形式是一个终点(endpoint)分析,具有卓越的灵敏度、特异性和信噪比。所有Cignal Reporter Assay都有此形式可供选择。每个分析包含了通路聚焦的转录因子报告载体,不可诱导的阴性对照,以及萤光素酶和GFP阳性对照。

• GFP形式则是监控活细胞通路调控的理想方法,具有单细胞分辨率。目前部分Cignal Reporter Assay具有此形式。它包含通路聚焦的转录因子报告载体,以及必需的阴性和阳性对照。


 
图1. Cignal Reporter Assay的流程概况

当然,并非所有细胞都能够轻松转染。QIAGEN也考虑到这个问题,并提供了一种慢病毒形式的Cignal Reporter Assay,这就是Cignal Lenti Reporter Assay。它是立即可转导的慢病毒颗粒,实现了任一种哺乳动物细胞中信号通路的测定。此系统将转录因子报告基因技术与强大的慢病毒导入力量相结合,是功能基因组学和药物开发中评估通路活性的强有力工具。

应用

Cignal Reporter Assay Kit甫上市,就受到了研究人员的欢迎。它应用广泛,适合因基因沉默(siRNA、shRNA或miRNA)而引起的表型变化、因基因过表达而引起的功能变化、干扰肽段和重组蛋白的影响,以及小分子化合物或候选药物的作用等研究。QIAGEN的科学家也曾做过一些研究,利用p53 Cignal Reporter Assay Kit,阐明了Dicer siRNA的生物学功能,并测定了Notch1对p53转录活性的影响。

案例1 – 评估候选药物的作用

去年,美国德州大学西南医学中心Hamon治疗肿瘤学研究所的研究人员在《Cancer Research》杂志上发表了一篇关于非小细胞肺癌的研究成果,说明SMAC类似物(JP1201)以IAP依赖而非TNF-α依赖的方式增加非小细胞肺癌对多种化疗药物的敏感性1。他们在研究中采用的正是Cignal Reporter Assay。

癌细胞通过上调抗凋亡因子,如凋亡蛋白抑制剂(IAP)来逃避凋亡,IAP可与caspase结合从而隔离它们或抑制它们的蛋白酶活性。过去的研究发现,只有一小部分表达TNF-α的非小细胞肺癌对SMAC类似物敏感。在这项研究中,研究人员试图确定SMAC类似物(JP1201)是否能增加非小细胞肺癌细胞系对传统化疗的敏感性。

在信号通路研究中,他们选用了Stress and Toxicity Cignal Finder 10 pathway reporter array。HCC4017、HBEC30KT、H1395和H157细胞被反向转染了通路特异的报告载体,之后,细胞经过JP1201或JP1201 + vinorelbine处理。24小时后,研究人员测定了萤火虫萤光素酶相对海肾萤光素酶的活性,从而确定了多条通路的活性。他们发现,在组合疗法中,只有内质网应激通路激活。因此,研究人员得出结论,JP1201让非小细胞肺癌对多种化疗药物敏感,但这种敏感不依赖于TNF-α信号通路,而是依赖于内质网应激通路和线粒体诱导的凋亡通路。

案例2 – 功能基因组学:评估RNA干扰表型

Dicer酶是核糖核酸酶III家族的成员,它切割双链RNA(dsRNA),形成两类长度约为20-25 nt的小RNA。一类是microRNA(miRNA),它们抑制翻译,另一类是小干扰RNA(siRNA),它们靶定同源RNA进行选择性破坏。Dicer突变体在转录本破坏和翻译抑制上存在缺陷,表明Dicer是siRNA和miRNA信号通路所必需的。然而,目前尚不清楚Dicer knockdown对p53信号通路的影响。于是,研究人员采用p53 Cignal Reporter Assay Kit,来研究Dicer siRNA对p53信号通路的生物学影响。

研究对象是293-H细胞。细胞分别转染了p53 Cignal Reporter Assay、阴性对照和阳性对照,以及Dicer siRNA或阴性对照siRNA。在开展双萤光素酶分析之后,研究人员发现,Dicer的knockdown会下调p53信号通路(图2)。这些数据表明,p53信号通路的调控受到miRNA和/或siRNA的严格调控。


 
图2. p53 Cignal Reporter Assay表明,Dicer siRNA处理负调控了p53的转录活性。

案例3 – 功能基因组学:评估过表达表型

Notch信号通路是细胞间通讯的一个重要机制,在细胞命运决定和分化上扮演了重要角色。Notch基因家族编码了进化上保守的I类跨膜受体。Notch通路的活性主要取决于与其他信号通路的相互作用。为了了解293-H细胞中Notch信号通路与p53信号通路的相互作用,研究人员使用p53 Cignal Reporter Assay,来研究Notch1如何影响p53信号通路。

用p53 Cignal Reporter Assay、阴性对照和阳性对照转染293-H细胞。转染24小时后,用100 MOI组成型表达活性Notch1的重组腺病毒(Ad-NICD)或100 MOI表达GFP的重组腺病毒(Ad-GFP)感染细胞。之后开展双萤光素酶分析。结果表明,活性Notch1的过表达激活了p53信号通路,导致p53转录活性的诱导(图3)。这表明,在293-H细胞中,Notch信号通路正调控了p53信号通路。


 
图3. p53 Cignal Reporter Assay表明,Notch信号通路正调控了p53信号通路。

这些应用证明了Cignal Reporter Assay Kit是功能基因组学研究中的理想工具,可评估siRNA、shRNA和cDNA的生物学影响。此外,通过此技术,研究人员也能阐释小分子化合物和重组蛋白的生理功能和脱靶效应。

结语

目前,QIAGEN提供了多个关键通路的Cignal Reporter Assay Kit,包括癌症生物学(Notch、Wnt/β-Catenin、TGFβ、p53、HIF、Myc、E2F、NFκB)、细胞周期控制(E2F、p53、Myc)、免疫学(NFκB、NFAT、I型IFN、IFNγ)、细胞增殖(MAPK/JNK、MAPK/ERK、C/EBP、Myc)、发育生物学(Notch、Wnt/β-Catenin、TGFβ)、核激素受体生物学(雌激素受体、糖皮质激素受体、视黄酸受体)、缺氧信号(HIF、p53、E2F、Myc)、G偶联蛋白受体信号(MAPK/ERK、NFAT、CRE)、PKC/CA++信号和cAMP/PKA信号。欢迎索取详细资料~~

参考文献
1. Rachel M. Greer, Michael Peyton, Jill E. Larsen, et al. SMAC Mimetic (JP1201) Sensitizes Non–Small Cell Lung Cancers to Multiple Chemotherapy Agents in an IAP-Dependent but TNF-a–Independent Manner. Cancer Res 2011; 71:7640-7648.

(生物通 余亮)

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