FFPE样品制备和分析宝典（四）[心得点评]

本文介绍了制备和保存FFPE样品的方法，其目的在于尽量减少因固定和包埋过程而引起的DNA、RNA和蛋白质量下降。之后介绍了流程中的提取和分析步骤，并详细介绍了如何高效地从FFPE样品中回收可分析的生物分子，以及需要作出哪些必要的修改，以便开展逆转录和实时定量PCR等下游应用。专家巨献，FFPE分析宝典，绝对不容错过！

全世界福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片的存档代表了珍贵且来源广泛的生物医学研究材料。随着越来越多的研究人员转向FFPE样品的分子分析，开发特定的操作步骤，考虑这些样品的独特性质就变得越来越重要。

FFPE样品制备和分析宝典（一）

FFPE样品制备和分析宝典（二）

FFPE样品制备和分析宝典（三）

成功的FFPE样品分子分析的关键因素

如前文所述，福尔马林固定和石蜡包埋会损害从组织样品中获得的核酸质量。在本文中，我们解释了FFPE样品中的低质量分析物将如何负面影响FFPE样品的分子分析，并就克服这一挑战提出了一些必要措施。

1 RNA质量控制

在开展RNA样品的质量控制时，通常测定的参数包括260 nm和280 nm的吸光度比值（对于10 mM Tris•Cl，pH 7.5中的纯RNA，A260/A280比值在1.9-2.1）以及28S rRNA与18S rRNA的比值（2:1的比值意味着完整RNA）。通过毛细管电泳（如QIAxcel® System）分析RNA样品，可指示RNA的片段化状态（图17）。QIAxcel实现了最多96个RNA FFPE样品的分析，而无需人工干预。它的分析比其他质量控制系统更快，操作也更简单，因为它使用即用型的凝胶卡夹。

图17. 来自FFPE样品的RNA的质量控制分析。大鼠肾脏样品经过福尔马林固定和石蜡包埋。在包埋后立即切片（上图），或保存12个月后再切片（下图）。利用RNeasy FFPE Kit纯化总RNA。纯化后的RNA在A QIAxcel或B Agilent 2100 BioAnalyzer上分析。

Agilent 2100 Bioanalyzer等系统还产生RIN（RNA完整性系数）或类似值，从1到10。RIN值为10表明高度完整的RNA，而RIN值为1则表明高度片段化的RNA。尽管这些参数给出了RNA纯度和完整性的概念，但没有提供化学修饰方面的信息。如上文所述，福尔马林固定引入了分子之间的交联，而甲醛对RNA的修饰会损害下游的酶学分析，如RT-PCR（图18）。

图18. 福尔马林固定和石蜡包埋对RT-PCR效率的影响。各种大鼠组织经过福尔马林固定和石蜡包埋。在包埋后3天（T0）或在4°C、20-25°C或37°C保存一年后，利用RNeasy FFPE Kit纯化RNA。在Agilent 2100 Bioanalyzer上分析RNA完整性，RIN值如图所示，电泳峰图详见图4。纯化后的RNA用于一步法RT-PCR，使用的是QIAGEN OneStep RT-PCR Kit和大鼠Hprt1基因的不同引物对，产生了128、208、404和669 nt的扩增子。RT-PCR也利用新鲜组织的RNA开展，作为阳性对照，并开展无模板RT-PCR，作为阴性对照。结果表明，FFPE样品中较长扩增子的扩增受损。此外，PCR表现与RNA完整性不相关。这是因为，对于大部分样品，甲醛对RNA的化学修饰是限制因素，而非RNA片段长度。（数据引用自von Ahlfen et al. [2007] Determinants of RNA quality from FFPE samples. PloS ONE 12, e1261.）。

因此，来自FFPE样品的RNA质量的评估应包含一套RT-PCR分析，以确定扩增子大小的上限。或者，对于oligo-dT靶定的cDNA，可利用不同引物对开展实时定量RT-PCR分析，以产生相似大小的扩增子，它们距离RNA转录本的3’端越来越远。扩增反应的成功程度将指示整个转录本中RNA降解的程度。由于oligo-dT靶定不建议用于FFPE样品的RNA，故第一种方法是首选。

至于Agilent 2100 Bioanalyzer上高度片段化RNA样品的分析，根据我们的经验，RIN值为4或以下不能提供太多信息或重复。对于高度降解的RNA，我们认为，最好使用峰片段长度（它可从峰图中推导出）作为RNA完整性的度量。

2 通过PCR和实时定量PCR开展DNA分析

正如前文所述，由于福尔马林交联的引入，FFPE样品中的基因组DNA常常严重片段化并修饰。QIAamp DNA FFPE Tissue Kit对基因组DNA的纯化确实会逆转一些交联，但其他交联是不可逆转的，在纯化后仍然存在。因此，需要一个可靠的PCR系统，来高效扩增这种困难的模板类型。既然只有一部分起始模板可以扩增，那么PCR高灵敏度和特异性才是FFPE样品成功检测的前提。HotStarTaq® DNA Polymerase和HotStarTaq Plus DNA polymerase再加上QIAGEN特有的PCR Buffer，为这种类型的起始模板提供了高度灵敏的PCR。此外，在开展FFPE样品的基因组DNA的PCR或实时定量PCR分析时，我们强烈建议设计尽可能短的扩增子。

3 通过实时定量RT-PCR开展基因表达分析

基因表达的分析可通过实时定量RT-PCR来实现，其中从样品中纯化得到的RNA先通过逆转录转化成cDNA，之后可实时扩增和检测所需的cDNA目标。

如果实时定量RT-PCR的引物能扩增cDNA和基因组DNA序列，那么RNA样品中基因组DNA污染的存在会影响基因表达分析的准确性。因此，必须避免基因组DNA污染，以保证准确的结果。利用RNeasy FFPE Kit、miRNeasy FFPE Kit或AllPrep DNA/RNA FFPE Kit纯化RNA，可实现这一点，它们包含了一个步骤，可从分离的RNA中去除痕量的小片段基因组DNA。此外，实时定量RT-PCR也可作为两步法应用开展，利用QuantiTect Reverse Transcription Kit进行cDNA合成，接着利用QuantiFast PCR Kit进行扩增。在cDNA合成过程中，QuantiTect Reverse Transcription Kit通过新颖的gDNA Wipeout技术去除基因组DNA污染。另外，实时定量RT-PCR也可作为一步法应用开展，使用QuantiFast® Probe RT-PCR Plus Kit，它在实时定量RT-PCR开始之前去除基因组DNA污染。有了QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit，所获得的CT值明显高于其他方法，那些方法依赖基因组DNA的含量和基因表达的水平。这并不是因为试剂盒的PCR灵敏度较低，而是它只检测cDNA，而不是cDNA和基因组DNA（图19）。

图19. 基因组DNA的高效去除带来准确的基因表达分析。利用RNeasy FFPE Kit，从人的乳腺、肝脏或肾脏FFPE样品中纯化总RNA。对多个表达水平不同的不同目标开展双重、实时定量RT-PCR，带有（+RT）或不带（-RT）逆转录步骤，使用的是QuantiFast Probe Assays（FAM™标记）和A QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit或B 另一个多重PCR试剂盒，不包含gDNA去除步骤。所有反应在ABI StepOnePlus™循环仪上开展。A -RT样品的高CT值表明无扩增，且不存在基因组DNA污染。因此+RT样品所获得的CT值反映了可靠且准确的RNA检测。目标12（TUSC2）和13（EZH2）不表达。这些结果表明，QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit有效去除了基因组DNA。B -RT和+RT样品的CT值相似说明了基因组DNA污染可检测到，让这些结果不可靠。

在逆转录反应中，最常用的引物是随机六聚体或oligo-dT引物。然而，这些引物并不适用于FFPE组织中化学修饰和片段化的RNA。使用oligo-dT引物时，逆转录从mRNA转录本的poly-A尾巴开始。因此，如果RNA严重片段化或被甲醛修饰，那么只有对应于转录本3’端的cDNA才能合成。随机六聚体更为合适，特别是对于表达谱研究（如芯片分析）。不过它们也有限制，特别是研究单个基因的表达时。只有与目的扩增子相近的随机六聚体才能产生实时定量PCR分析所需的cDNA目标。由于这些六聚体只占逆转录反应中全部六聚体的一小部分，所以它们的起始效率非常低。

为了在实时定量RT-PCR中获得最佳的结果，应当在逆转录步骤中使用与目的扩增子相近的基因特异引物。或者，使用oligo-dT引物和随机引物，如QuantiTect Reverse Transcription Kit一样。此外，应设计实时定量PCR步骤的引物，让扩增子尽可能短。如果选择的扩增子长于将要扩增的RNA片段，会导致不准确的结果。FFPE样品中RNA片段的大小通常在50-300 nt，大部分片段的大小在100 nt左右。QuantiFast Probe Assays是基于成熟的水解探针技术（5’ 核酸酶技术，如TaqMan®），利用专利算法而设计，通过探针型实时定量RT-PCR来实现FFPE样品的基因表达分析。QuantiFast Probe Assays能够扩增和检测不超过100 bp的RNA和cDNA目标，效率和可靠性都很高（图20）。

图20. FFPE样品中RNA的高效实时定量RT-PCR检测。利用RNeasy FFPE Kit从乳腺组织FFPE样品中纯化得到总RNA（1 ng、100 pg、10 pg和1 pg）。在Rotor-Gene Q循环仪上扩增和检测人MUC1基因的转录本，利用的是QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit和QuantiFast Probe Assay（蓝色曲线）或供应商AII的预设计分析（红色曲线）。与供应商AII的分析相比，QuantiFast Probe Assay的结果表现出较低的CT值和更高的灵敏度。利用QuantiFast Probe Assay可检测低至1 pg的模板（利用供应商AII的分析无法检测1 pg）。

FFPE样品的珍贵性意味着只有少量RNA才能回收，这限制了实时定量RT-PCR分析的数量。在需要分析大量基因时，这可能是一个严重的问题。为了增加可供分析的cDNA量，可在逆转录和实时定量PCR之间引入一个预扩增步骤。通过RT2 FFPE PreAMP技术，在cDNA合成之后开展多重PCR，预扩增cDNA目标，这些目标来自特定通路或疾病状态的基因。在预扩增之后，利用适当的RT2 Profiler PCR Array，每个cDNA目标可通过实时定量PCR单独定量（图21）。RT2 FFPE PreAMP技术不仅提高实时定量PCR分析的灵敏度，还保留了原始的基因表达谱。

图21. cDNA目标预扩增之后的芯片分析。利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit从人乳腺FFPE组织中纯化总RNA。随后利用RT2 FFPE PreAMP技术对RNA进行逆转录。利用Human Cell Cycle RT2 Profiler PCR Array通过实时定量PCR开展基因表达分析，比较一个肿瘤样品和一个非肿瘤样品。ΔΔCT分析表明，肿瘤样品与非肿瘤样品的基因表达相差x倍。

4 利用焦磷酸测序开展甲基化和突变分析

焦磷酸测序是一种新颖的技术，实现了核苷酸序列的可靠测序以及目的序列内遗传变异（如CpG位点的甲基化或突变）的灵敏、准确定量（图22和23）。由于FFPE样品中的DNA分子互相交联，并与其他分子交联，那么在焦磷酸测序分析之前必须去除这些交联。使用EpiTect Plus FFPE Bisulfite Kit（图22）或QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（图23）从FFPE样品中纯化基因组DNA，可确保福尔马林交联的部分逆转（一些交联是不可逆的），为扩增和随后的焦磷酸测序分析提供了适当的DNA模板。

图22. 利用焦磷酸测序开展DNA甲基化分析。利用EpiTect Plus FFPE Bisulfite Kit从大鼠肝脏FFPE组织（10 μm）中纯化DNA。利用PyroMark PCR Kit扩增APC基因上的3个CpG位点，并利用PyroMark Gold Q24试剂开展焦磷酸测序分析。峰图显示了可靠的焦磷酸测序长读取以及每个CpG位点甲基化水平的灵敏定量（蓝色背景）。以黄色高亮显示的位点是对照位点，证明了DNA的完全亚硫酸氢盐转化。

图23. 利用焦磷酸测序开展突变分析。利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit从结肠癌FFPE组织中纯化DNA。利用KRAS Pyro Kit开展焦磷酸测序，以便鉴定KRAS基因中的突变。A 一个密码子12和13的基因型正常的样品分析后的峰图轨迹。B 一个密码子12中第2位碱基发生GGT ➞ GAT突变的样品分析后的峰图轨迹（核苷酸35，箭头所示）。

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原文《Critical factors for molecular analysis of FFPE samples》由QIAGEN提供，生物通负责编译。

（全文完）