雅培公司新型病原微生物快速鉴定系统PLEX-ID

【字体：大中小】 时间：2012年07月11日 来源：

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　　2009年3月，美国，两份发热性呼吸系统病患的咽拭子样本，通过疾控中心（CDC）实验室应急网络，运送到海军健康研究中心。借助雅培病原微生物快速鉴定系统得到的结果：该病毒株不与数据库中的任何一条信息完全匹配；系统提示*接近甲型H1N1猪流感病毒，且其基因组同时包含了人流感、猪流感和禽流感病毒的序列。没人意识到，一个波及200多个国家和地区，持续一年多共造成了将近2万人死亡的流感疫情由此拉开序幕。凭借该系统出色表现，雅培公司摘得2009年《华尔街日报》技术创新奖金牌

雅培公司在2009年推出了新型的病原微生物快速鉴定系统PLEX-ID，整合了两大诺贝尔奖成果：PCR（链式酶链式反应）和电喷雾质谱（Electrospray Iionization Mass Spectrometry，ESI-MS）。其中PCR是迄今为止*成熟，使用*广泛的核酸检测技术，已被应用于科学研究、体外诊断、食品安全、法医鉴定等多个领域；而质谱法从**台质谱仪问世至今已将近一个世纪，也被应用于各种大分子和小分子的定性和定量分析，雅培公司的该系统根据核酸检测的特性选择了一种较为温和的电离方法——电喷雾电离法，可以避免大分子在离子化过程中的破碎，非常适合于核酸的质谱检测。整个系统是一个能快速检测混合样本中病原微生物的系统，检测类型包括了已知和未知的微生物。产品推出之前，该技术平台已经在2009年爆发的H1N1流感大流行中小试牛刀，其强大功能可见一斑。

让我们回溯到2009年3月28日，在美国的帝国郡，采集到了一个咽拭子样本，该样本来自一个患有发热性呼吸系统疾病的9岁女孩。两天之后，从另一个患有同样症状疾病的10岁男孩身上采集了一个类似的样本，此次的地点是在圣地亚哥郡。此时，可能大家都没有意识到，一个持续一年多的流感疫情由此拉开了序幕。此次疫情波及200多个国家和地区，共造成了将近2万人死亡。

基于常规的检测方法，*初两个病例只能被鉴定为某种未知类型的甲型流感病毒感染。这两个病例的咽拭字样本分别通过疾病控制与预防中心（CDC）的实验室应急网络，运送到了海军健康研究中心（NHRC），借助于病原微生物快速鉴定系统，在收到样本数天之后即得到了鉴定结果。经过序列比对之后，这两个病例所感染的病毒株不与数据库中的任何一条信息完全匹配，说明这是一株新的甲型流感病毒，但根据已知的病毒序列数据，系统提示该病毒*接近甲型H1N1猪流感病毒，且其基因组同时包含了人流感、猪流感和禽流感病毒的序列。凭借该系统在甲型H1N1流感病毒鉴定中的出色表现，雅培公司摘得了2009年《华尔街日报》技术创新奖的金牌。

那么PLEX-ID是什么类型的产品？它的技术平台为何能在短时间内鉴定出混合样本中未知流感病毒的类型？带着这样的疑问，让我们来看看PLEX-ID的来龙去脉。

PLEX-ID的前身是由IBIS公司开发的一套生物鉴定质谱系统，取名T5000，主要为美国军方在生物反恐方面提供服务。雅培公司（Abbott）正是看中了T5000系统在病原微生物快速鉴定方面的出色表现和巨大潜力，于2009年收购了IBIS公司，并将T5000升级为PLEX-ID病原微生物快速鉴定系统，该系统集成了PCR扩增、产物自动脱盐纯化、质谱分析、数据库比对给出鉴定结果的高通量鉴定系统。为配合PLEX-ID系统的运行模式，雅培公司推出了配套的样本前期处理产品，其应用范围扩大到生命科学、公共卫生及医学的研究和应用等民用领域，并将其迅速推广到全球。

PLEX-ID的工作原理是，每种病原微生物都有可以与其它种间或种内病原亚型得以区分的基因组序列，这样的序列被称之为病原微生物特异性序列；如果能将这些病原微生物的特异性序列一一识别，即可判断样本中有什么病原。PLEX-ID就针对病原体微生物的高可变区两端的保守序列设计特异性的扩增引物，且在同一物种的多个靶序列设计引物以确保检测结果的准确性；并采用多重PCR对目标序列进行扩增，减少了样本的用量，其扩增条件也经过了优化，保证了实验的稳定性。通过扩增获得这些序列产物后，即可用质谱法检测这些产物并对其进行区分。PLEX-ID使用的质谱为电喷雾电离质谱，相对基质辅助激光解吸附电离法（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization，MALDI），电喷雾电离法是一种相对温和的电离方法，可将进入其飞行器的核酸分子双链分开为单链，在毛细管的出口处会发生喷雾，雾化成细小的带有电荷的雾滴，避免了核酸在离子化的过程中打成碎片，因此更适用于核酸的质谱分析。由于分子量小的核酸片断荷质比高而飞得快，反之分子量大的核酸片断荷质比低而飞得慢，根据到达终点的时间差别而将不同核酸片段大小的特异性片段区分开来，每条核酸片段由于组成的碱基序列有所差别而使得飞行速度产生差别，据此将飞行速度兑换为核酸的重量，再将不同的核酸重量对应出不同的核酸组成，通过比对PLEX-ID巨大的数据库，继而对应出相应的核酸序列做为判别病原体微生物的种属。

PLEX-ID的优势在于：⑴无需对样本进行培养，即可对样本中已知、未知或新出现的微生物进行检测和分析；⑵能把样本中的基因组片段进行扩增，并对扩增产物的碱基组成进行分析，独有的分析软件可把检测到的碱基组成于数据库中的信息进行比对，达到识别微生物的目的；⑶数据库中含有75万条微生物基因组扩增片段碱基组成信息，并持续更新，从而把扩增产物与特定微生物进行关联；⑷24小时内能处理分析多达250个样本；⑸从样本制备到微生物鉴定不到8小时；⑹提供了一个微生物检测平台，通过使用不同的配套试剂盒，可检测细菌、病毒、真菌和原生动物，并鉴定微生物的基因型，检测毒性标记和抗药性基因；⑺能识别单一样本中的混合微生物。

目前，PLEX-ID已经进入中国市场，华山医院和复旦大学医学院已率先利用该产品进行了结核分枝杆菌耐药基因检测的研究，文章于2011年发表在《临床微生物杂志》（Journal of Clinical Microbiology）。此外，雅培公司也已经与一些研究单位开展了合作测试，以下举两个案例，可以从中看到其强大的功能。

PLEX-ID系统相比实验室常规方法更加灵敏，且无需预先知道所要检测的目标微生物。有10份送检到雅培的全血基因组DNA样本，研究者希望检测其中是否存在巴尔通体感染。巴尔通体是一种立克次氏体，可以导致巴尔通体病，临床症状为Oroya热和秘鲁疣。该实验室用常规方法进行检测，10份样本的结果均呈阴性，但仍心存质疑，借助PLEX-ID高灵敏度的测试和强大的数据库检验，10份样本都感染有一种或几种的不同类型的巴尔通体，其中一份样本还感染了巴贝斯原虫，为准确及时地诊断提供了有力的依据。

PLEX-ID能检测混合样本中的低丰度菌，且数据库存在超过75万条的微生物序列信息并持续更新。另一份到雅培公司送检的病人样本，该病人带有布鲁氏菌感染的症状，且血清学结果提示布鲁氏菌抗体呈阳性反应，但常规方法只检测到纤维单胞菌这种病原体，使用蛋白质谱的方法也不能检测到布鲁氏菌的蛋白。该实验室想确认样本中到底是否含有布鲁氏菌，采用PLEX-ID的广谱细菌试剂盒以及Biothreat试剂盒分别进行检测，结果都检测到了布鲁氏菌的存在，但其含量仅为优势菌纤维单胞菌的1/20左右。