少量RNA样品的miRNA图谱分析[新品推荐]

在开展miRNA图谱分析时，并非每个实验的对象都是细胞系，有时，我们需要处理RNA含量有限的样品，如体液、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品，或者细胞数量少的样品，如激光捕获显微切割（LCM）样品、流式分选细胞、循环肿瘤细胞和细针穿刺活检。这时，RNA含量低让我们束手无策。

为此，QIAGEN推出了miScript PreAMP PCR Kit。它实现了高度多重、基于PCR的预扩增，让含有极少量RNA的起始样品也能用miScript PCR System来进行miRNA定量。miScript PreAMP PCR Kit，与miScript PreAMP Primer Mixes共同使用，可提供足够的模板，以便我们开展多次分析。

miScript PreAMP PCR Kit的优势：
 实现了FFPE、血清/血浆、LCM和体液样品的miRNA图谱分析技术
 利用10 ng或更少总RNA分析多条通路或整个miRNA组
 内置的对照可评估预扩增效率
 轻松的步骤可整合到miScript PCR System流程中

miRNA图谱分析的突破技术

miScript PreAMP PCR Kit，与miScript PreAMP Primer Mixes共同使用，是一项突破性的技术，仅用10 ng或更少总RNA即实现了全面准确的表达分析。一次10 ng cDNA合成反应可作为最多10次预扩增反应的模板。这提供了足够的模板，便于利用多个通路或疾病聚焦的miScript miRNA PCR Arrays开展miRNA图谱分析，或miRNome miScript miRNA PCR Array的多次筛查，具体取决于所使用的miScript PreAMP Primer Mix。miScript PreAMP PCR Kit在一个反应内对最多400个miRNA特异的cDNA目标进行高度多重、基于PCR的预扩增。一般来说，预扩增在96重或384重反应中实现了2000-4000倍的扩增。

完整的miScript PCR System流程

利用miScript PCR System对RNA含量低的样品开展miRNA图谱分析是基于SYBR® Green实时定量PCR。下列三个步骤依次开展：利用miScript II RT Kit的逆转录、利用miScript PreAMP PCR Kit和miScript PreAMP Primer Mix的预扩增，以及利用相应miScript miRNA PCR Array和miScript SYBR Green PCR Kit的实时定量PCR。因此，利用miScript PreAMP PCR Kit和miScript PreAMP Primer Mix的预扩增已经完全整合到miScript PCR System的miRNA图谱分析流程中，确保了稳定的操作和重复可靠的结果。

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完全可控的实验

miScript PreAMP PCR Kit包含4个miScript Primer Assay，用于预扩增对照实验，以检测预扩增的cDNA（详见表1）。适当对照的使用确保了可靠、易于阐释的结果。

表1. miScript PreAMP PCR Kit中的对照

对照	目的
miR-16 miScript Primer Assay	确定预扩增cDNA的最佳稀释倍数，如果模板的起始量未知
SNORD95 miScript Primer Assay	利用ΔΔCT相对定量法实现组织和细胞样品的数据标准化 确定预扩增cDNA的最佳稀释倍数，如果模板的起始量未知且miR-16不存在
C. elegans miR-39 miScript Primer Assay	测定miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control（如果纯化过程中已添加），以确定血清和血浆样品的回收
miRTC miScript Primer Assay	评估逆转录效率

少于1 μl血清或血浆的miRNA变化分析

miScript PreAMP PCR Kit提供了一个机会，可从少量样品和RNA含量极低的样品中挖掘出大量、可靠的miRNA图谱分析数据。过去无法使用的样品如今也能提供miRNA表达和功能方面的宝贵信息。通过预扩增，< 0.1 μl血清相当的RNA也能用于Serum & Plasma miScript miRNA PCR Array，实现miRNA表达的可靠分析（图1）。

图1. 从1/10 cDNA中检测到的miRNA 100%增加。

与未扩增样品的结果高度相关

利用miScript PreAMP PCR Kit的可靠、无偏向扩增提供了与未扩增样品高度相关的数据，确保了结果的高可信度。肿瘤和正常肺组织FFPE样品所产生的miRNA表达谱的比较证实了这种很强的相关性（图2）。

图2. 利用1/100起始cDNA的预扩增保留了表达模式。

重复的结果和可靠的操作

利用miScript PreAMP PCR Kit的预扩增是一个可靠的操作过程，确保了一致、重复的结果。当不同用户开展预扩增和miRNA表达谱实验时，他们获得了高度重叠的结果（图3）。

图3. 高的技术重复性。

广泛的应用

作为miScript PCR System的一部分，miScript PreAMP PCR Kit适用于：

 有限样品的成熟miRNA定量和图谱分析
 血清或血浆、其他体液或存档FFPE样品的生物标志物发现

原文《miScript® PreAMP PCR Kit》由QIAGEN提供，生物通编译，略有修改。