科学家们将皮肤细胞转变成神经元细胞[创新技巧]

【字体: 时间:2012年09月29日 来源:FLUIDIGM

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  Dr. Zhiping 与 Dr. Ami Citri合作,在操控人类胚胎和出生后的成纤维细胞转变成功能性的神经元细胞(iN)的研究中取得突破性研究进展。这篇文章和其他的相关操作流程描述了他们如何将干细胞和产后皮肤细胞转变成神经(脑)细胞的工作。

应用
- 单细胞基因表达

Fluidigm技术
- Biomark系统
- 48.48动态微流体整合芯片

介绍
 
美国斯坦福大学医学院以转化开创性医学研究为病人提供优质护理而闻名。Dr. Zhiping(原分子和细胞生理学系博士后)和Dr. Ami Citri(精神病和行为学系博士后)结合他们的努力,与其他研究人员一道在Nature Protocols杂志上发表了题为Induction of human neuronal cells by defined transcription factors, Nature; and also Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells的文章。这篇文章和其他的相关操作流程描述了他们如何将干细胞和产后皮肤细胞转变成神经(脑)细胞的工作。Dr Pang 说:“这些工作不仅在利用细胞模型研究人类神经疾病方面迈出了重要的一步,而且也将对解读表观遗传学如何调控神经细胞的分化和成熟提供重要的参考。”

挑战
 
作者在文中测试了两种假设:1)确定强制性表达的转录因子是否可诱导人类多能干细胞获得神经元细胞特性,2)非神经元的人成纤维细胞是否也可被转换成神经元。Citri博士说:“zhiping来找我,他需要这个项目能够在单细胞水平上评估细胞群落中的多样性。”他说:“要评估转换成神经细胞的效率,成熟细胞的水平以及转化后获得特定的神经细胞的属性都是理解从其他细胞诱导成神经元细胞的基础。因此我们建立了一个流程,利用Fluidigm的动态整合微流体芯片来评估单个神经元。我们从一组相对大量的单细胞样品中,检测了一套胶质生物标记、神经元标记或成纤维细胞的标记物以评估神经元的转换过程的效率和特异性。我们从小鼠神经元细胞开始,尝试着检测从Fluidigm公司平台获得的数据的质量情况,但它的有效性立即让我们吃了一惊。”

Dr Zhiping Pang在编写这篇文章及本报告中提到的流程时是斯坦福大学医学院分子和细胞生理学系博士后。目前他是新泽西州儿童健康研究所和罗伯特•伍德•约翰逊医学院的神经科学和细胞生物学系助理教授。他的工作重点是研究肥胖症。

Dr Ami Citri博士是在斯坦福大学的精神病学和行为科学系做博士后的时候进的行这项研究。 2012年夏天,他将担任耶路撒冷的希伯来大学的高级讲师(助理教授)。他的工作重点是在成瘾症的研究。

Dr Citri 认为:“Fluidigm的方法效力非常巨大,我几乎不会再回头去使用传统的定量PCR方法了。”

解决方案

在他们的第一个实验中,为了确定在人类多能干细胞中表达转录因子是否可诱导神经元的属性,在未分化的人类胚胎干细胞(ES)中转染了Brn2,ASCL1和myt1l(作者称为“BAM”)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。经过处理后,他们观察到双极类神经细胞及成熟的神经元形态,并表达典型的神经元细胞TUBB3和MAP2蛋白。电生理分析显示,这些细胞产生了动作电位。因此BAM因素可在人类干细胞中诱导出神经细胞的的差异。在他们的第二个实验中,他们想了解非神经元人成纤维细胞是否也可以被直接转换成神经元。他们用BAM因素+ NEUROD1转染初级人类胎儿成纤维细胞系(HFFs)。这些因素可产生成熟的神经元细胞,表达神经丝蛋白,及体现神经元的一些表征过程,包括具有synapsin and synaptotagmin(两个突触囊泡蛋白)染色阳性。因此,BAM+NEUROD1因素可诱导非神经元人成纤维细胞的神经细胞分化。
 
方法

使用Fluidigm公司的48.48动态芯片进行单细胞基因表达分析。通过簇电极(patch electrodes)抽取收集生长在培养皿中的单细胞,并喷出到CellsDirect™缓冲液(Invitrogen)中,然后快速冷冻直到下一步工序。解冻的细胞进行特定目标的逆转录和18个循环的PCR进行预扩增(STA)。 预扩增产物在BioMark系统上进行实时PCR分析。为确保特异性的扩增,在每个实验中包含梯度滴定的人脑总RNA,并只对表现出线性扩增的引物进行分析。此外,对单细胞和对照RNA的PCR产物熔解曲线进行比较,以确保PCR产物的特异性。BioMark系统为验证免疫荧光和电生理的表型数据提供了另一层面的数据。这些研究人员在Nature protocols杂志上发布了他们的实验路程:Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells。Dr Pang说:“当人们谈论以传统的方式做单细胞PCR时,我从来没有留下深刻的印象。这是低通量的,他们不能运行验证测试。但有了Fluidigm公司的技术,我们可以使有多个内部对照,我们可以确定一个实验是否能工作。该系统给了我们完美的结果。真正让我感到惊讶的是,当我们重复了其中一个芯片的实验,我们得到几乎相同的结果,所以它是高度可重复的。我们认为,在神经科学界的其他人可能有兴趣做这方面的工作。因此,我们写了这个操作流程的文章并被杂志接受。”
 
技术优势
 
虽然这些研究人员主要使用的的BioMark系统进行神经元的研究,他们说,他们相信其他领域的研究也可以受益于这项技术。 “任何需要进行细胞群落在单细胞水平的多样性的研究、及任何受起始原料限制的领域,这都将是富鲁达技术发挥巨大效应的地方。”Citri博士说。“这可以是人的活组织切片检查,或因为器官太小而从少量的组织中开始首次实验,也可以是任何应用激光捕获的显微切割样品,或提取的一个非常明确的细胞群体。”

Dr Pang说:“单细胞基因表达分析适用于许多领域,包括细胞生物学和神经学。当有异质性的细胞群,细胞特异性基因转录的识别就变得非常重要。”在这个研究之后,这两个科学家已经接受了在各自新的研究机构的学术职位,但他们都打算继续使用富鲁达的平台进行单细胞的研究。
 
“Fluidigm的方法效力是如此的巨大,我几乎不会再回头去使用传统标准的定量PCR方法。”Dr. Citri说。“这是非常有用的,因为它让我用高效率和低成本的方式验证微芯片(microarray)数据。当我在各种应用中检测大量的基因时,我不需要每次用微芯片来处理样品。我可以用富鲁达公司的微流体芯片用数百个探针研究很多样本。从原始的微芯片实验中我已经创建了一个候选基因和定量PCR探针数据库。此外,有效地利用最小的样品量,可以让我把我的样品作成一个文库,每当一组新的基因成为我的兴趣焦点时我可以不断对他们进行检测。对我来说,这是Fluidigm公司系统的巨大优势之一。”
 
Dr Pang在2011年11月开始在新泽西州儿童健康研究所和罗伯特•伍德•约翰逊医学院的神经科学和细胞生物学系担任助理教授进行独立科研工作。

“我实验室的研究重点是:研究从干细胞到大脑的突触调节机制。我有兴趣了解肥胖人的食物摄入行为是如何被身体的激素和神经肽改变的。”他说, “一个有趣的现象是,在下丘脑区域有一组神经元表达瘦素(leptin)受体,但它们对瘦素的反应有很大差异。我推断下丘脑不同的细胞有不同的基因表达模式,这些只能用单细胞基因表达谱来解析。我的另一个研究方向是用人的成纤维细胞或多能性干细胞诱导成神经细胞,用这作为细胞模型来研究人类神经系统疾病。单细胞的基因分析将是在我的实验室中研究这些突触调控会使用的主要技术之一。”

“任何需要进行细胞群落在单细胞水平的多样性的研究、及任何受起始原料限制的领域,这都将是富鲁达技术发挥巨大效应的地方。”

— Dr. Citri博士

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