DNA合成:你应该知道的秘密[创新技巧]

【字体: 时间:2013年01月30日 来源:生物通

编辑推荐:

  DNA化学合成固有的错误率较高,片段越长越是如此,挑选序列正确的克隆所花费的时间和金钱比DNA合成要多去了。挑克隆着实花费了无数学生们的不少好时光。所以,大家的选择标准也从价格渐渐回归到质量。各厂家之间,从过去拼价格,拼速度,到如今,拼的是纯化质量了。不纯化,PAGE纯化,HPLC纯化,到反相纯化,有多大区别?

说起DNA合成,几位前辈师兄师姐们犹会提起上世纪90年代世行贷款买仪器,好些单位甚至医院都赶时髦买了DNA合成仪,买回来才发现自己那点合成需求和费用,委实买得起用不起,那昂贵的设备成了摆设。彼时国外DNA合成虽然质量好纯度高,可寄回来海关不好过,时间上实在伤不起,幸亏国内迅速崛起的几家DNA定制合成供应商,以到货速度快和价格优势渐渐占据了低端市场,对于实验室来说,DNA定制合成于是变成了发传真+等收货那么简单的事。

也没那么简单。DNA化学合成固有的错误率较高,片段越长越是如此,挑选序列正确的克隆所花费的时间和金钱比DNA合成要多去了。挑克隆着实花费了无数学生们的不少好时光。所以,大家的选择标准也从价格渐渐回归到质量。各厂家之间,从过去拼价格,拼速度,到如今,拼的是纯化质量了。不纯化,PAGE纯化,HPLC纯化,到反相纯化,有多大区别?纯化过的DNA oligo是不就去除了全部错误序列呢?我们得先从DNA合成的错误成因谈起:

1. 内部缺失(n-1,n-2 etc)产物。这是化学合成DNA最普遍与最主要的限制因素,且不能通过纯化DNA oligo来解决这个问题。化学合成DNA不及活细胞内DNA复制具有高保真性,在活细胞内,存在大量的校正与修复系统,将碱基突变率降低至1/(1×106)以下。PCR反应也具有较高的保真度,例如:错误率在1/1000——1/10000,并且还可通过DNA 聚合酶的性能提高保真度。但是化学合成DNA不同,每单个合成循环的错误率约为1/100,随碱基数目增加而增加。其原因包括:

(1)DNA oligo的化学合成是碱基与碱基之间通过化学反应偶联而成,而化学反应的偶联效率一般在99%左右,也就是说,在每次进行偶联反应时,都会有1%的DNA片段附加不上新的碱基,对这种截断的失败序列,为了防止其参与后续的偶联反应,采用CapA与CapB进行化学封闭,以阻断其延伸,但化学封闭反应的效率不可能达到100%。导致出现合成失败的DNA片段或截断序列残留在合成的DNA粗制品中。

(2)DNA oligo的不完全脱保护。寡核苷酸的完全脱保护包括从磷酸酯基团、碱基上的环外氨基和5′-OH部分上去掉保护基团。脱保护的化学反应效率不可能达到100%,未脱保护的碱基无法参加偶联反应而导致DNA oligo内部缺失碱基。

(3)不断延长的DNA链与不断累积的副产物会干扰DNA oligo的化学合成。

对于以上三方面问题,至今为止还没有找到一个完美的解决方案。因为延长盖帽时间也不能保证封闭反应效率达到100%;而对于脱保护反应来说,增加脱保护试剂量及延长脱保护时间又会导致DNA oligo脱嘌呤。因此只能采取折衷方法将不完全脱保护与脱嘌呤同时控制在低水平上。内部缺失碱基的截断序列绝不可能100%去除干净,对于几种纯化方法来说,OPC或HPLC不可能去除内部缺失碱基的截断序列,最好的方法是通过PAGE纯化降低截断序列数量。

2. 单核苷酸的插入是存在于目的DNA oligo产物中的另一种常见的序列错误。

当同一DNA oligo分子中存在G-偶联或单碱基插入(n+1)同时又存在单碱基缺失(n-1)时,此条DNA oligo的长度与目的DNA分子的长度相同,因此无法通过OPC 、HPLC或PAGE纯化将此“失败序列”去除。 DNA oligo化学合成存在的这些弊端曾被Hecker KH与Rill R报道过(Error analysis of chemically synthesized polynucleotides. Biotechniques,1998 Feb;24:256-260)。在这篇文章中,作者合成并PAGE纯化了长链DNA oligo,用它们进行PCR克隆,然后测序鉴定了10个克隆,发现存在7个单碱基缺失,一个连续的4个碱基缺失,一个G-C替换。除了这些碱基错误,其它学者还曾报道存在G-偶联、分支及其n+x产物。

为了解决上述碱基出错的问题,首先要优化化学合成方法来提高DNA oligo的纯度,并且对DNA oligo粗制品进行纯化,虽然无论哪种纯化方式都不能保证百分之百去除错误序列,但能改善产品的纯度,进而提高实验的成功率。Oligo的纯化方式最常见的有脱盐、OPC、PAGE和HPLC。脱盐只能去除氨、盐等杂质,而不能有效去除合成过程中产生的短片段,因此一般只能用于普通的PCR反应和测序。HPLC和PAGE纯化得到的纯度很高,但只能进行手工操作,相当费时费力。OPC不仅能去除短片段,当DNA oligo的长度在40 bases以内,其纯度与HPLC或PAGE纯化的纯度相当,而且由于简便、快捷,能进行高通量(high-throughput)和自动化(automation)操作,因而受到很多DNA合成公司的青睐。

但OPC纯化也有一个缺点,就是在操作过程中需要一种弱酸脱掉DMT基团,而DNA Oligo在酸性条件下容易脱嘌呤(depurination)。对于脱嘌呤后的碱基,DNA聚合酶不能识别,可能导致PCR扩增后出现碱基缺失或错配。因此,有些公司不推荐OPC纯化用于克隆、突变、基因合成等实验。

一般来说,不同厂家的合成方法其实并没有什么大的本质的区别,只是有一些经验的积累和技巧。比如脱保护剂浓度的选择很重要,太低脱保护不完全,太高又增加脱嘌呤的机率,还有如何优化程序,使盖帽更充分、更完全等等…。纯化方式的选择,一般说来修饰标记要用HPLC纯化,长链要用PAGE 纯化,但这两种纯化方式都非常费时耗力。

赛百盛近期对OPC纯化技术进行了改进,在此基础上建立了一种基于DMT-on的纯化技术——QPC纯化,终于解决了这一令人困扰的难题。QPC纯化选用了一种比较温和的酸脱保护,经反应优化,既保证了脱保护完全,又尽量降低了脱嘌呤的风险,DNA Oligos正确率较高,特别适合量大、用于克隆、定点突变、基因合成等高端实验的DNA合成纯化。

研究结果表明,OPC纯化的DNA oligo脱嘌呤的发生率最高时可达30%,而QPC纯化的脱嘌呤发生率不到3%。因此用QPC纯化的DNA oligo出错率大大减少,对于长度在60 bases以内的Oligo的纯化效果也很好。经全基因合成验证,赛百盛公司自动纯化(QPC纯化)的DNA oligo正确率较高。合成长度约1kb的基因,从8个克隆中可以挑选到5个左右完全正确的基因序列,因此QPC纯化的Oligo适用于克隆、定点突变、基因合成等实验。

了解DNA合成服务的更多信息

了解这些事实,有助于你做出适合自己的选择。虽然合成DNA oligo出错的风险无法避免,实际操作中挑到正确克隆的可能性还是很大——但别忘了多挑几个克隆!
 
降低出错的建议包括:

(1)对DNA oligo合成产物进行纯化。
(2)建议多挑几个克隆(而不仅仅是一个或两个克隆),一般情况下会挑到正确的克隆。
(3)减少转化后预温育时间(未加抗生素)。因为在未加抗生素情况下,延长温育时间可能会导致单个突变克隆的扩增。
(4)挑克隆时,应挑选分隔良好、新鲜的、不太大的单菌落。
(5)尽可能选择合成短的Oligo而避免合成长度大于60 bases的Oligo,实在要合成长序列,时间充裕的话选择国外合成。

我来说两句
0  条评论    0 人次参与
登录 注册发布
最新评论刷新
查看更多评论 > >

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

生物通首页 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器龙虎榜

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号