白血病检测的故事：从显微镜到数字PCR[创新技巧]

Alec Morley博士是澳大利亚弗林德斯大学血液病学系的教授。他多年来一直从事白血病的研究。最初的工具是显微镜。当病人患上急性淋巴细胞白血病（ALL），有经验的病理学家会很轻松地找到许多白血病细胞。不过，Morley指出，一旦白血病细胞的比例降至1%以下，就无法用肉眼检测到。“这就是个黑匣子。”

于是，Morley和他的同事开始寻找新的工具来打开这个黑匣子。最初，他们应用的是PCR，来检测ALL中的基因重排。定性检测是成功了，但能不能定量呢？为了回答这一问题，他们将细胞培养中的方法应用在PCR上。

有限稀释PCR

Morley曾经开发出一种技术来克隆淋巴细胞，以研究体细胞突变。将生长中的细胞分配在多个孔中，他发现突变克隆的生长遵循泊松分布。于是，他将这一原理应用在PCR上，将细胞替换成分子。这一过程，他们称之为“有限稀释PCR”，也就是数字PCR的前身。

然而，这是个相当艰苦的实验过程。据当时负责这项工作的Simhee Neoh介绍，他要进行许许多多次手工稀释，以找到一个正确的稀释点。一旦找到，他还要开展多个PCR反应，跑胶，并用宝丽来相机来拍摄每个结果。只有当大量凝胶跑完之后，他们才能汇集结果，开展泊松分析，并得到量化结果。污染也是个需要注意的问题，因为需要许多不同的样品，并开展巢式PCR反应。

尽管过程很艰苦，但他们的努力终于得到了回报。研究人员能够检测急性白血病的水平，这在治疗过程中经常发生变化。与显微镜相比，他们能检测更低水平的白血病细胞。具体来说，是0.01%，而不再是1%。

灵敏度的极大提高让他们打开了ALL的黑匣子。据Morley介绍，利用这种数字PCR过程，“我们能够根据微量残留病的水平，将患者分成三组：有些会治愈，有些会复发，及中间组。这种分类被许多更大型的研究所证实，成为治疗改良的基础。”

同时，研究小组也在许多期刊上发表了他们的成果。最让人激动的是，1994年在《柳叶刀》上发表文章，说明利用有限稀释PCR来高灵敏度地定量白血病细胞，可测定对治疗的响应，从而预测白血病的预后。

Morley及其同事也在《Biotechniques》上发表了他们的数字PCR研究，作为一种通用的定量方法。这篇文章被广泛引用，是数字PCR的早期重要文献之一。然而，即使他们获得了成功，但Morley等人还是逐渐远离它，开始转向实时定量PCR。“这是个好方法，但不实际，”Morley说。

微滴式数字PCR

如今，Morley还在继续努力寻找更好的方法来测定和监控白血病。他的公司，Monoquant，正在开发一种技术，利用患者的DNA来定量慢性粒细胞白血病（CML）。

为了简化这种DNA方法，Morley开始采用Bio-Rad的微滴式数字PCR（ddPCR）技术，来测定CML中特有的BCR-ABL易位。Morley认为：“微滴式数字PCR就像之前Simhee手工开展的工作。每个液滴包含一个PCR反应，读取为阳性或阴性的荧光。不再需要辛苦跑上25块凝胶，你可在几分钟内获得20,000个液滴，并快速读取。”

这种大规模的液滴带来了绝对定量目标序列所需的分辨率，而不需要标准曲线，这也是相对实时定量PCR的一个好处。“我们相信，微滴式数字PCR将让我们实现更精确的BCR-ABL易位的定量。”

尽管在DNA水平定量BCR-ABL实现了更灵敏的检测，但它也需要患者特异的方法。每个易位发生在基因组中一个独特的断裂点，但这些差异会在RNA转录过程中被剪接掉。为了获得足够的特异性，Morley创建了一个引物系统。“对不同的患者有不同的引物，而它们在效率上各不相同，”Morley解释道。“微滴式数字PCR很少受到扩增效率差异的影响。我们认为这会使监管机构更加看好我们。”

Morley也意识到实用性和精确性，因为他想要开发广泛应用的诊断检测。他认为；“在不同的仪器之间进行选择时，你需要真正了解具体的需求。我们称之为各有所长（horses for courses）。Bio-Rad的ddPCR技术带来了我们想要的，灵敏度水平满足我们的需求，而且它很快速。因此，这是显而易见的选择。”

“我选择血液学，是因为这是个东西能够量化的领域。你能回答问题，因为你能测定它们，”Morley谈道。“这是个了不起的事情。测定是个了不起的事情。”事实上，Morley的一生都在关注这种“大海捞针的问题”，找到并定量一种很小但很重要的标志物，从而帮助患病的人们。

Morley一直相信，如果他可以提出正确的问题，就能找到可测定的答案。从早期PCR技术的创新，到如今应用微滴式数字PCR技术，Alec Morley已经做到了这一点。（生物通编译）

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参考文献：

Brisco MJ et al. Outcome prediction in childhood acute lymphoblastic leukaemia by molecular quantification of residual disease at the end of induction. The Lancet 343, 196–200.

Sykes P et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. BioTechniques 13, 444–449.