2014技术展望：PCR/克隆

PCR和克隆是我们十分熟悉的技术，熟悉到我们都有些陌生了，不清楚最新的进展。其实，方法开发者一直在努力扩大其用途，近年来也有一些让人吃惊的结果。那么，这些经过时间考验的技术又将会带来一个怎样的未来？也许会是更大、更快、更小。

1. 更大。你想要将一个DNA片段插入载体中？没问题。那么两个片段呢？好吧，难一点，但是也能做到。那五个怎么样？如今我们正走入一个灰色地带；这可能需要一些时间。随着研究人员在合成生物学等领域的研究愈加深入，他们需要一些克隆方法，以一种简单的方式插入多个DNA片段，比如不依赖于连接的克隆（LIC）或Gibson拼接。

Gibson拼接是JCVI的Daniel Gibson在2009年发明的新方法。它利用核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶进行拼接，需要相邻的具有重叠序列的DNA片段。核酸外切酶从5’ 端降解核苷酸，且不与DNA 聚合酶竞争。双链DNA 被消化产生突出的单链DNA，重叠序列特异性退火，此时，外切酶逐渐热失活。DNA聚合酶和DNA连接酶修复连接成完整的双链 DNA分子，从而实现无痕拼接。这种技术非常高效，而我们有理由相信，2014年在大规模基因拼接上有更多改进。

2. 更快。PCR需要时间。我们需要反复的变性、退火和延伸，才能产生足够量的产物用于分析。但如果这一过程能够加快而不影响质量呢？在过去几年，随着DNA聚合酶和PCR仪器的改造，PCR技术已经变得越来越快。然而，随着人们对个性化医疗和基因检测的兴趣日益增加，也希望看到新的快速且高质量的PCR方法。目前，许多新的测序策略都依赖重新改造的聚合酶，这也预示着迷你PCR的革命。2014年，我们有望看到这些重新改造的聚合酶的更多应用，包括更快的PCR循环条件，更小、可移动的仪器，将PCR从传统实验室的局限中解放出来。

3. 更小。近两年，单细胞成为大家关注的焦点。尽管我们有大量关于细胞群体的数据，但我们对单个细胞的行为还是知之甚少，比如它如何应对特定的刺激。在2013年，许多研究都关注单细胞水平的生物学，而研究人员也热衷于每次对一个细胞进行研究。

尽管单细胞分析存在不少挑战；起始材料的量太少，很难确保只有单个细胞。但随着新技术的出现，如数字PCR和微滴式数字PCR，以及微流体技术的改进，研究人员也开始实现单细胞生物学的探索。到2014年，我们预计单细胞应用的数量会激增，而适用于单细胞的PCR方法也会如雨后春笋般冒出来，带来新的生物学发现。

今年是PCR技术的“三十岁生日”。这些年来，从PCR到定量PCR再到数字PCR，技术在不断发展，也带来更广泛的应用。下一个三十年，也许PCR会给我们带来更多惊喜。（生物通 薄荷）