细胞迁移与侵袭分析全接触[选购宝典]

【字体: 时间:2013年12月10日 来源:生物通

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  细胞迁移分析通常在细胞培养物中开展,目前流行的方法主要有:Boyden小室、细胞划痕分析、间隙封闭分析(gap-closure assay)等。微流体技术是近年来兴起的新技术。它的样本量较少,适用于宝贵的细胞和化合物,但价格嘛,当然会贵一点,也略为复杂。

细胞迁移是个基本的过程。从简单的单细胞生物,如变形虫,到复杂的多细胞生物,如哺乳动物,都存在这一过程。细菌通过鞭毛或纤毛而运动,胚胎细胞聚集在一起形成新生的组织,免疫细胞向感染灶迁移以清除病原菌,而肿瘤细胞从原发部位释放,入侵更远的地方。许多研究人员希望深入了解这些迁移过程。为此,他们需要开展细胞迁移分析。

这些实验通常在细胞培养物中开展,目前流行的方法主要有:Boyden小室、细胞划痕分析、间隙封闭分析(gap-closure assay)等。微流体技术是近年来兴起的新技术。它的样本量较少,适用于宝贵的细胞和化合物,但价格嘛,当然会贵一点,也略为复杂。

Boyden小室分析

多年来,经典的Boyden小室分析一直是细胞迁移分析的首选方法,也是目前最广泛引用的方法。1962年,Boyden发明了Boyden小室法,又称滤膜小室法。Boyden小室由上、下两室组成,中间以微孔滤膜隔开。将趋化剂加入下室中,形成梯度,而细胞接种在上室中。受趋化剂影响,细胞会穿过膜上的微孔移动到另一侧。之后,通过固定、染色和观察,我们可确定有多少细胞发生了迁移。

这种方法适用于悬浮细胞和贴壁细胞,可以检测趋化梯度下的迁移情况,操作简单,可多孔同步进行。缺点是,趋化剂的浓度梯度是未知且可变的,而且这种方法只能进行终点分析,很难观察到迁移过程中的细胞。需要注意的是,我们必须选择比细胞直径略小的滤膜孔径。如果细胞在梯度的刺激下,它们会拼命挤过去。

在标准的Boyden小室分析中,滤膜的孔径一般在3-12 μm,可根据所研究的细胞来选择。孔径较小,这对迁移的细胞而言是个较大的挑战。大部分细胞的大小在30-50 μm,可有效通过3-12 μm的孔,而淋巴细胞(10 μm)却能通过0.3 μm这么迷你的孔。

据默克密理博的专家介绍,选择适当的孔径很重要。那么,该如何选择呢?一般来说,3 μm的孔径适合白细胞或淋巴细胞迁移。5 μm的孔径适合成纤维细胞或癌细胞,如NIH-3T3和MDA-MAB 231 细胞。也适合单核细胞和巨噬细胞。而8 μm的孔径适合大多数细胞。这一孔径支持大多数上皮细胞和成纤维细胞的最佳迁移,但不适合淋巴细胞。

据悉,大约只有5%-10%的细胞将迁移过去,其中大部分是在分析的前3-6小时完成迁移。为了获得最大的灵敏度,并将实验组与对照组的差异最大化,最好能接种尽可能多的细胞,并限制运行时间。

然而,细胞迁移后的人工计数也是件痛苦的事。为了简化这一过程,BD Biosciences公司提供了另一种自动计数的解决方案。BD的FluoroBlok™ Cell Culture Inserts采用独特的膜结构,能够阻止490-700nn的光线穿透。因此,你可以在下室中检测荧光,而光线不会到达上室。利用这一系统,荧光标记的细胞穿过滤膜,就可以自动被底部读取的荧光酶标仪或荧光显微镜所检测。这种方法能够实时观察细胞的迁移动态,这也意味着Boyden小室不再限于终点分析。

细胞划痕分析

细胞划痕分析也被形象地称为伤口愈合分析。它通常是用移液器的吸头在融合细胞上划出一道划痕,然后继续培养细胞,观察细胞向划痕区域的迁移情况,来判断细胞的迁移能力。这种分析在技术上要求不高,也不贵,通过显微镜可比较实验组或对照组的迁移潜能。但它们也有个缺点:很难制造均一的划痕,细胞和基质在此过程中会受损,而这些会让您难以实现每孔间的一致性。

当然,这并不是个难以解决的问题,默克密理博就以梳子来代替吸头,引入均一的划痕。Cell Comb™ Scratch分析带来了一个更具重复性的选择。Cell Comb™经过优化,可引入许多均一且高密度的划痕,创建更多表面积让细胞意识到这儿有个伤口,同时留下了足够的细胞来完成迁移。

了解Cell Comb Scratch分析的更多信息


间隙封闭分析

间隙封闭分析与划痕分析有些类似,也是让细胞迁移到无细胞的区域,但不会出现“伤口”。它通常是在细胞培养时放置某种屏障(比如小塞子),来阻止细胞生长。实验开始后,移除屏障,就可以观察细胞的迁移情况。这种方法的优点在于能实时地连续观察细胞移动,也不存在细胞损伤,但不适用于悬浮细胞。

Platypus Technologies的Oris细胞迁移检测板是一个96孔板形式的耗材,硅胶块能封住中心区域,使这一区域无法铺种细胞。当硅胶块移除后,周围细胞迁移进入中心区域,此时可以使用活细胞试剂,如Calcein-AM进行荧光标记,或将细胞固定后标记细胞核进行检测分析。而Cell Biolabs的CytoSelect™分析是使用0.9 mm的聚碳酸酯插槽来形成间隙。在细胞接种并贴壁后,移除屏障,这样细胞就开始向间隙迁移。

这两家公司也提供可溶解的屏障。Oris Pro分析采用生物相容性的凝胶,干燥时是固体,而添加培养基后会溶解。当凝胶溶解时,细胞已经粘在孔的底部。至于Cell Biolab的Radius™分析,它采用专门的细胞培养板,板上布置了水凝胶。凝胶位于每个孔的底部。当细胞接种于孔中时,细胞将粘附于Radius™凝胶以外的其他位置,从而创建出一块无细胞的区域。细胞接种后将Radius™凝胶移除,这样细胞便可朝着该区域迁移并逐渐封闭。

细胞侵袭分析

在细胞侵袭中,细胞需要破坏或调节细胞外基质(ECM)或细胞间相互作用,这更接近于肿瘤背景下所发生的的。肿瘤细胞降解ECM蛋白的能力与转移潜能直接相关。在Boyden或transwell分析中加入一层ECM蛋白,可将细胞迁移分析转换成侵袭分析。

涂有不同ECM蛋白的小室可从多个供应商处购买,包括Corning和BD Biosciences。BD BioCoat Matrigel 侵袭小室采用了8 μm、透明型PET膜,适用于低通量的终点检测。BioCoat 肿瘤侵袭系统具有24孔和96孔小室规格,并使用8 μm BD FluoroBlok膜。这种小室系统不仅具有了FluoroBlok独立小室的所有优点,还可以与大多数的仪器以及液流处理系统相匹配。此外,ECM蛋白也可添加到间隙封闭和微流体分析中。

细胞侵袭到ECM也往往伴随着富含肌动蛋白的突起的形成。这些结构被称为invadopodia(癌变细胞)或podosome(非恶性细胞)。默克密理博也提供了一种新颖的分析——QCM™ Gelatin Invadopodia分析,来检测invadopodia形成和ECM降解。

这款试剂盒能够将荧光标记的明胶粘附在玻璃基质上,并将肌动蛋白细胞骨架、细胞核以及降解位点共定位,以便观察正常和恶性细胞所产生的降解。当荧光标记的明胶被降解后,就不再发出荧光。通过图像分析,可定量这种降解,并追踪潜在的激活剂或抑制剂对invadopodia形成和ECM降解的影响。目前,这款试剂盒有红色和绿色可供选择。同样地,Life Technologies也提供淬灭荧光素标记的胶原蛋白和明胶,一旦被消化掉,就发出荧光。

一直以来,细胞迁移分析的重点在于模拟体内的细胞行为。然而,许多研究人员却认为它们缺乏生理意义。近几年,人们逐渐了解到,基质的一些参数(如刚性和微结构)也会对细胞迁移的方式产生重大影响。这也促使人们开始在3D环境中研究细胞迁移和侵袭。未来,这可能是个新的研究热点。(生物通 余亮)

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