IHC全攻略5：对照的重要性[心得点评]

适当的对照对于IHC/ICC结果的准确阐释至关重要。令人满意的IHC/ICC实验设计可产生结果，说明抗原位于正确的组织、细胞类型或亚细胞定位。固定、封闭、抗体孵育和抗原修复步骤的优化将产生强烈而特异的信号。然而，有时实验也会出现假象哦，蒙蔽了你的双眼。因此，IHC/ICC实验必须包含阳性和阴性对照。

此外，抗体特异性、实验条件、组织类型之间生物学条件、甚至研究人员的差异都可能产生不一致的染色，导致不准确的结论。为了实现性能一致，详细记录是IHC/ICC研究的一个重要因素。在此，我们介绍了一些公认的对照，可支持您IHC/ICC结果的特异性。

内源组织背景对照

某些细胞和组织可能有着固有的生物学性质，产生背景染色，从而导致结果的误读。在一抗上样之前，应利用荧光（适用于荧光标记）或明视场（适用于显色标记）照明在显微镜下检查细胞和组织，以确保组织本身没有信号。例如，脂褐质是一种内源的自发荧光色素，可与阳性染色混淆。

无一抗对照

将组织与抗体稀释液孵育，其中不包含一抗的对照通常也是必需的。之后与二抗和检测试剂孵育。只用检测试剂染色应该是可以忽略的，它不会掩盖特异染色，也不会类似于特异染色的模式。

同型对照

在使用单克隆一抗时，可利用此对照。将样品与抗体稀释液孵育，并添加与一抗相同亚型（如IgG1、IgG2A、IgG2B、IgM）和浓度的非免疫球蛋白。之后将样品与二抗和检测试剂孵育。这些步骤将确保特异染色所出现的不是由免疫球蛋白分子与样品的非特异相互作用引起的。背景染色应该是可以忽略的，与特异染色不同。

吸附对照

为了证明抗体是与目的抗原特异结合，首先要将抗体与免疫原预孵育。这会使抗体失活，组织应该无染色或很少染色。抗原与抗体的混合物应以10:1（摩尔比）配制，并在4 °C预孵育过夜。随后将预吸附的抗体与组织共同孵育，以取代一抗。将一抗产生的染色模式与预吸附抗体产生的相比较。

如果免疫原是肽段，那么吸附对照效果更好。不过，如果抗体是由整个蛋白产生的，则抗体与蛋白混合物的添加可能导致更高的非特异染色。尽管机理还不清楚，但有可能是预吸附所用的抗原本身与组织结合，产生非特异染色。因此，必须注意，使用整个蛋白的吸附对照不一定能验证抗体与组织中蛋白结合的特异性。

 
大鼠背根神经节中的吸附对照。A. 利用anti-human phospho-MSK1亲和纯化过的多克隆抗体（货号AF1036）对大鼠背根神经节冰冻切片中的磷酸化MSK1（S212）进行染色。B. 如果抗体用S212磷酸化免疫原预先吸附，则细胞核染色（箭头所指）不见了。

组织类型对照

IHC/ICC实验的其他对照包括使用已知表达（或不表达）目的表位的组织样品。这种策略可提供有用的参考，也可使用在初步优化研究中。来自转基因动物的组织特别有用，它们表达或不表达抗原。此外，不同物种的组织样品也可包含在内，以支持抗体的物种特异性。

Western Blot有必要吗？

人们常常开展Western blot实验，以补充或支持IHC/ICC研究。不过，在变性过程中蛋白构象的变化可能产生误导性的结果。对于某一特定抗体，Western blot与IHC/ICC研究之间的不一致可能只是反映出实验条件的差异。由于多克隆抗体识别多个表位，故没那么容易产生这种实验假象。

欢迎索取《R&D Systems IHC指南》

（原文来自R&D Systems，生物通编译，略有修改）