IHC全攻略8：问题到底出在哪儿？[心得点评]

从技术上说，IHC和ICC实验并不难，然而，每个实验又有那么多的变量需要鉴定和优化。若运气不佳，实验结果不太好，那么我们可能要做个troubleshooting，看看问题到底出在哪儿。下表就列出了IHC/ICC实验的常见问题，以及相应的对策。

问题1：缺乏染色

可能原因	对策
缺乏抗原	通过原位杂交检查蛋白表达。
因储存不当，抗体不起作用	按照说明书上的说明储存。一般来说，将抗体分装成小份，足够单次实验使用。将这些抗体储存在手动除霜的冰箱中（-20 to -70 °C），避免反复冻融。
一抗或二抗失活	独立检测报告系统，以评估试剂是否有用。
组织固定不足	尝试增加固定时间或换一种固定剂。
组织过度固定	减少浸润或固定后步骤的持续时间。如果浸润固定无法避免，那么通过抗原修复试剂，让抗原不被遮蔽。
一抗与二抗不兼容	使用能与一抗相互作用的二抗。例如，如果一抗来自兔子，那么就使用抗兔的二抗。
在固定或包埋过程中表位已改变	通过各种抗原修复技术尝试恢复免疫反应性。 在58°C或以下包埋组织。
抗原修复不起作用	增加处理时间或改变处理溶液。
试剂遗漏或顺序不对	重复染色过程，确认使用了正确的试剂，并以正确顺序添加。

问题2：高背景

可能原因	对策
一抗或二抗的浓度高	滴定抗体，以确定促进一抗和二抗的特异反应所需的最佳浓度。。
组织中抗体和蛋白的疏水相互作用	降低抗体稀释液的离子强度（特别是单克隆抗体）。
一抗或二抗与组织的非特异结合	在一抗孵育之前采用封闭步骤（通常使用1% BSA和10% 正常驴血清）。脱脂奶粉也是个选择。
二抗的非特异结合	使用交叉反应性IgG被去除的抗体。
组织变干	在染色过程中避免让组织变干。
离子相互作用引起的背景	提高稀释液的离子强度。

问题3：细胞/组织形态被破坏

可能原因	对策
抗原修复方法太过剧烈	根据经验确定实验条件，既能保留组织形态，又能恢复抗原的免疫反应性
组织切片从玻片上脱落	增加固定时间。根据经验确定另一种固定剂。
组织切片撕裂或折叠。切片下有气泡	重新切片，或在分析结果时忽略受损区域。
组织形态的分辨率差	切出更薄的组织切片。冰晶可能会破坏冰冻切片的形态。
固定不足在染色过程中会导致组织或细胞受损	延长固定时间。提高固定剂/组织的比例。切出更小的组织，以便更彻底的浸润。
组织自溶导致坏死碎片的染色	延长固定时间、比例。考虑使用交联的固定剂。

问题4：染色不当

可能原因	对策
固定方法不当	尝试另一种固定剂，或延长固定时间。
抗原修复可能不当	尝试另一种抗原修复条件。
抗原的静电荷被改变	尝试调整抗体稀释液的pH或阳离子浓度。
固定拖延导致抗原扩散	快速固定组织。尝试交联固定剂，而不是有机固定剂。

（原文来自R&D Systems，生物通编译）