千年基因应用全基因组及转录组测序研究肺癌融合基因

【字体: 时间:2013年04月15日 来源:千年基因

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  为了鉴定NSCLCs的新分子靶标,我们对一个33岁肺腺癌病人(该病人不吸烟而且没有家族癌症史)的癌症组织和正常组织分别进行全基因组和转录组高通量测序。在该癌症样本中并未发现EGFR、KRAS或EML4-ALK融合基因等已知驱动突变。这里,我们报道了在KIF5B和RET原癌基因之间通过10p11.22–q11.21臂间倒位产生的新融合基因。

鉴定导致癌症转化的分子事件,对于通过发展靶向药物来提高肺癌的临床治疗效果非常重要。在过去的十年中,很多研究已经报道了关于非小细胞肺癌(NSCLCs)基因组上的驱动突变。然而,仍然不清楚超过40% NSCLCs的分子致病机理。为了鉴定NSCLCs的新分子靶标,我们对一个33岁肺腺癌病人(该病人不吸烟而且没有家族癌症史)的癌症组织和正常组织分别进行全基因组和转录组高通量测序。在该癌症样本中并未发现EGFR、KRAS或EML4-ALK融合基因等已知驱动突变。这里,我们报道了在KIF5B和RET原癌基因之间通过10p11.22–q11.21臂间倒位产生的新融合基因。此融合基因过度表达了嵌合的RET受体酪氨酸激酶,它能自发导致细胞转化。在20个原发肺腺癌的验证研究中,我们在2个肺腺癌中鉴定到了KIF5B-RET融合基因。我们的数据表明,一部分NSCLCs是由KIF5B-RET融合基因导致的。嵌合的致癌基因可作为一种很有前景的分子靶标,用于肺癌的个性化诊断和治疗。

1、 研究背景

肺癌是全球死亡率最高的癌症之一,世界上每年有138万人死于肺癌。肺癌晚期病人的平均存活期自诊断时计算不足1年。在西方国家,吸烟是引起肺癌的主要风险因素,其中85%~90%的肺癌与吸烟有关。然而,世界范围内25%的肺癌患者是从不吸烟的。很多亚洲国家的数据显示,从不吸烟者占非小细胞肺癌(NSCLC)的30%~40%。肺癌中80%为NSCLC,主要组织类型是腺癌(>50%)。

过去几年中,在NSCLC中已经发现了一些体细胞突变,如EGFR,KRAS,EML4-ALK。但大部分肺癌患者的基因组中并没有发现这些突变。超过40%的NSCLC是由未知的遗传变异造成的。

2、研究策略

样本:

33岁男性,自祖父母开始没有家族史,从不吸烟,之前一直很健康。在肺叶右上方有未明显分化的腺癌,在PET研究中发现已转移到肝脏和多处骨骼,在病理诊断时,通过CT和超声引导分别对原发肺癌组织和肝转移组织进行活检,在已知突变EGFR,KRAS,EML-ALK的检测中呈阴性。其中,样本来自首尔国立大学基因组医学研究所(见图1)。

癌组织为石蜡包埋的原发肺腺癌组织,骨骼转移组织和冷冻的肝转移活检组织,对照为同一病人的外周血。进行已知基因排查时,用PCR和Sanger测序检测原发肺腺癌组织中的EGFR和KRAS突变,用FISH检测EML4-ALK突变,结果全呈阴性。

图1. 通过CT引导在原发肺癌组织进行活检后,伊红染色的石蜡切片

实验方法:

从原发肺癌组织,骨骼转移组织,肝转移组织和血中提取DNA,从冰冻肝转移组织提取RNA,从total RNA中合成cDNA。根据Illumina的标准protocol建库,用HiSeq2000和Genome Analyzer IIX测序。通过对肝转移组织和血分别进行47.77X和28.27X全基因组测序。骨转移样品和原发癌样品都是石蜡包埋,提取出的DNA质量不足以高通量测序建库,只能用于验证。因此本研究主要基于肝转移和血之间序列的比较(见表1)。

表1. 肺癌病人AK55测序分析的统计总结

为了进行重复验证,先选择5个EGFR,KRAS和EML4-ALK检测呈阴性的冰冻原发肺腺癌组织,用HiSeq2000进行转录组测序。另外,再选择15个冰冻原发肺腺癌组织,通过PCR和Sanger测序检测EGFR和EML4-ALK呈阴性,KRAS状态未知。

在全基因组测序的数据分析中,用GSNAP将短reads比对到参考人类基因组(Build36.3,hg18),找出SNV, short indel和large deletion。在转录组测序的数据分析中,用GSNAP将短reads比对到一些构建好的mRNA序列而不是参考人类基因组,以避免mRNA剪接导致的比对错误。通过PCR和Sanger测序,对KIF5B-RET融合基因进行验证。

3、研究结果

在肝组织里发现了10,390非同义SNVs,334 CDS indels,70 CDS large deletions。与血对比后剩下8非同义SNVs 和2 indels。SIFT注释后,发现8个非同义SNVs 的功能不足以导致癌症,被过滤。

对肝转移组织进行转录组测序(15.16G),并与全基因组测序比较(见图2),发现了52个融合基因和10个RNA 编辑。但10个RNA编辑的功能影响不足以成为driver mutation,被过滤。

图2. 肝转移肺癌组织的全基因组和转录组测序数据

52个融合基因中,49个是相邻基因间(<135kb)的染色体内融合,这可能在癌症发生中不起作用。有1个是染色体间融合,是由在肝脏中高度表达的haptoglobin (HP) 产生。但此基因功能被认为对细胞转换没有影响。剩下的KIF5B-RET和KIAA1462-KIF5B融合基因是较远基因间(>2MB)的染色体内融合。不过KIAA1462-KIF5B表达水平很低,且KIAA1462为分子功能未知的假设蛋白。只有KIF5B-RET可以在肝转移肺癌组织的全基因组序列中找到对应的染色体重排,并且在血的全基因组序列中没有找到对应的染色体重排。此融合基因之前未在人类癌症中发现(见图3、4)。

图3. KIF5B-RET融合激酶的功能结构域

图4. KIF5B-RET融合激酶的三维结构

通过转录组测序数据进一步确认了此融合基因的特征。此融合转录本高度表达,表现为34个discordrdant PE reads和60个跨过外显子接合点的spanning reads(见图5)。


 
图5. 通过跨过外显子交界处的测序结果检测出KIF5B-RET融合基因

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在技术性验证中,通过PCR和Sanger测序在肝转移肺癌组织的cDNA中也验证到此融合转录本。而且有较多reads(8 reads)支持,可以确定存在于肝转移肺癌组织的主要亚群中(见图6、7)。


      
图6. 通过跨过外显子交界处的测序结果              

图7. 通过Sanger测序在cDNA验证融合基因断裂点检测出KIF5B-RET融合基因  

KIF5B和RET彼此相距10.6Mb,分别位于10p11.22和10q11.2,在两条不同的链上,通过染色体反转形成融合基因(见图8)。


 
图8. 10号染色体发现的10.6 Mb反转

通过PCR和Sanger测序,在肺癌患者的原发癌组织、骨骼和肝脏转移肺癌组织的DNA中验证到染色体反转,从而确定此融合基因不仅存在原发肺癌组织,还存在于骨骼和肝脏转移肺癌组织中(见图9)。

图9. 通过反转特异性PCR和电泳检测KIF5B-RET融合基因

通过Sanger测序鉴定到染色体反转的断裂点。断裂点 (chr10: 42,931,604, hg18)下游2bp处鉴定1bp的删除,这表明错误DNA修复机制可能在双链DNA断裂后促成了反转(见图10)。


 
图10. Sanger测序鉴定染色体反转的断裂点

为了确定KIF5B-RET是否存在于其他原发肺腺癌组织中,选择5个没有EGFR,KRAS,EML4-ALK突变的原发肺腺癌组织进行转录组测序,在其中一个(LC_S2)发现也存在KIF5B-RET融合基因。用cDNA PCR进行技术验证时,也在LC_S2中验证到此融合转录本(见图11)。


 
图11. 针对KIF5B-RET 融合转录本进行cDNA PCR和凝胶电泳

另外,还挑选15个原发肺腺癌组织用cDNA PCR进行验证,它们没有EFGR和EML4-ALK突变,KRAS突变情况未知。其中一个(LC_S6)显示有KIF5B-RET融合基因。以上验证结果显示,KIF5B-RET融合基因不是稀有的,也存在于原发肺腺癌中(见图12)。


 
图12. 针对KIF5B-RET 融合转录本进行cDNA PCR和凝胶电泳

通过Sanger测序鉴定出3个样本中KIF5B-RET融合基因的断裂点。外显子的衔接方式各不相同(见图13)。


 
图13. AK55、LC_S2和LC_S6的KIF5B-RET融合转录本比较(蓝色代表KIF5B 的外显子,红色代表RET的外显子)

4、讨论

• 样本的正确设置是成功的前提,此样本具有典型特征:不吸烟者、年轻、多处转移、无家族史、无已知突变。
• 在不远的未来,全基因组和转录组测序是进行癌症诊断一项非常重要的程序,尤其对于那些癌组织中不存在已知癌症driver突变的患者。全基因组和转录组测序联合研究具有重要优势:首先,DNA和RNA测序数据之间的互相检验可以去除很多假阳性。人类基因组大约3G,即使全基因组测序的准确性达到99.9999%,一般也会产生数千个假阳性。第二,转录组测序能让我们只关注与活跃转录基因相关的特定基因组变异。癌症基因组包括数百个体细胞passenger突变,要从中分离出driver突变,需要表达水平的信息。第三,这样可以发现基因转录过程产生变异,如RNA编辑。最后,转录组测序比全基因组测序更容易提供由染色体反转或移位产生的融合基因的信息。
• 总结下支持KIF5B-RET融合基因具有致癌作用的证据。(1)通过分析发现的此融合基因,是基于不含任何已知driver突变的肺癌;(2)RET在其他癌症患者也是致癌基因;(3)RET的tyrosine激酶结构域只在含有此融合基因的肺癌样本中高度表达;(4)伴侣基因(KIF5B)有coiled-coil结构域,是激活致癌融合基因所必需的。
• 我们除了在一个肝转移肺腺癌组织中发现了1个KIF5B-RET融合基因,还在20个原发肺腺癌中发现了2个,因此我们估计此融合基因在肺腺癌中的频率为6%。不过此研究的样本量太小,还需流行病学研究来更准确地了解KIF5B-RET融合基因的频率。总之,这次发现的新KIF5B-RET融合基因可能作为治疗肺癌的一个好的分子靶标。

参考文献
A transforming KIF5B and RET gene fusion in lung adenocarcinoma revealed from whole-genome and transcriptome sequencing. Genome Research, 2011.

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