细胞中的众里挑一[新品推荐]

以组织为研究样本所获得的实验结果其实并不能真实反映单一细胞类型的生物学信息。由于生物体组织是由彼此相互联系的多种类型细胞所构成，正是由于这种结构上的复杂性，很难分离目的细胞，所以目前大多数的研究都是通过分析混合组织样品来获得数据。这些研究虽然能够提供一些生物学信息，但却具有很大的局限性，尤其是当其他类型的细胞占组织的主要部分，而研究对象只是其中很少或几个细胞类型时，目的细胞的信息会被大量非相关细胞的信号所掩盖甚至淹没，导致研究的可靠性降低。为了获得特定类型细胞的准确信息，分离出同质的目标细胞就显得至关重要。

激光显微切割技术的出现就是源于对同质细胞研究的需求，于20世纪90年代率先在医学领域中发端：利用激光将组织切片内单一细胞种类切割下来进行研究，避免间质细胞及一些炎症细胞造成背景“污染”，使得研究结果更加准确、可靠，同时避免了假阳性和假阴性结果出现。目前该技术广泛应用于肿瘤学、神经学、免疫学、病理学等临床和科研领域。

瑞士MMI公司是专业致力于显微操作产品生产的厂家，*新推出的整合性产品单细胞获取自动化工作站就是一款利用显微切割及操作技术完美的解决样本中同质性细胞获取的代表性产品，Olympus或Nikon的高端倒置显微平台上进行精细操作，硬件实现显微激光切割系统（MMI CellCut Plus）与单细胞挑选系统（MMI CellEctor Plus）的整合，使得绝大多数形式的样品（冰冻及石蜡切片、血细胞涂片、法医样本、体外培养的活细胞、悬浮细胞、甚至染色体等）都可以应用MMI单细胞获取工作站来进行单细胞的获取。

1 实验操作流程

1-1 悬浮单细胞获取流程：

滴加少量悬浮细胞    毛细管对单细胞吸取    显微操作吸取或刮取单细胞    下游实验

1-2 各种切片单细胞获取流程（冰冻、石蜡、涂片等）：

“三明治式”样本制备                         显微镜下观察并圈选目的细胞

激光对目的区域        样本采集        样本处理        下游实验

1-3 单个活细胞获取流程：

内皿培养细胞  标记目的细胞  激光切割目的细胞  取出内皿留目的细胞于外皿  下游实验

2 技术特点

2-1 样本的保护

激光显微切割技术常处于中游实验过程中，即上游需要样本的供给，下游需要完成切割后所获取样本或蛋白或基因等不同水平的分析；那么作为承上启下的关键环节，要做到上下游流程间数据的完整、真实地传递，首选要保证的就是对上游传递来的样本不做任何破坏或做到不可避免的损伤*小化，也就是样本的保护尤为重要。MMI单细胞获取自动工作站在整个显微操作过程中各个环节中如，样本制备、样本采集、低能激光器、激光路径精细等方面，都对样本进行着保护，*大限度地维持样本的完整性保证下游数据的真实可靠性。

2-1-1“三明治”式样本制备
   
三明治式样本制备，使样本被保护在膜片(MembraneSlide）与载玻片之间（如图1-1），避免了外界环境的污染及对核酸的降解，所以与其他的样本制备方式相比，三明治式的制备方法更大的保护了样本在经历显微切割这道工序的过程中不会因受到任何可能性的污染（图1-2）；同时使得样本不直接暴露在激光照射下所有样本不会被加热。

图1-1 三明治式样本制备

图1-2 样本制备过程

2-1-2 黏附式样本采集

采集管的管盖由硅胶填充，可以对膜片上的PET膜进行黏附。采集过程中，管盖所黏附的部位不是样品本身，而是与膜片中的PET膜黏附（图1-3），连同样本一起被收集到收集管中的PET碎片也不用担心会影响后续的实验，因为PET膜具有很强的化学惰性不易反应；既不强行干预（激光轰击采集）也不放任自流（重力自由落体采集）。

图1-3 黏附式样本采集

2-1-3 精细的切割路径

在切割过程中除了环境的污染会影响实验外，切割技术的精细程度也同样地决定的实验结果的优劣，粗糙的切割会对切割路径周边的部位造成损坏，破坏样品的完整性。MMI激光直径小，切割痕迹窄，可切割单个细胞甚至是染色体；在40x物镜下，切割痕迹0.8微米，100x物镜下，切割痕迹只有0.3微米（图1-4）。

图1-4 精细的切割路径

2-1-4 高频低能激光器及高精度步进马达

高频激光器保证切割路径的连续性，同时也就保证了获取样本的完整性；低能量激光进行切割不会对样本造成破坏性损伤，温和的切割方式对样本起到保护的作用（图1-5）；高精度步进马达控制载物台，步进精度达0.075微米，可对染色体等细胞亚单位进行精确切割分离。

图1-5高频低能与低频高能的比较

2-1-5  Z-Drill 功能

MMI 配备的载物台不仅能X/Y向轴移动，还能在Z轴向移动。激光器重新调焦后可沿着Z轴对样本进行“螺旋式”切割（图1-6）。Z-Drill功能实现了低能量激光对较厚和较潮湿的样本的切割，避免了因增加激光器功率造成的样本损伤，同时也增加了激光器的使用寿命。

图1-6  Z-Drill 功能

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2-2目的细胞的筛选

显微切割较为初步的筛选细胞的方法就是依据特定的细胞形态认为判断来进行切割；这样的筛选方法显然不是十分准确的，挑选的细胞就很容易掺杂者非同质细胞，影响实验的准确性；所以往往需要一些方法来在显微操作精细度保证的前提下来对我们的目的细胞进行细致的筛选，才能保证我们*终获得信息的可靠性、真实性、特异性，从而实现显微操作获取细胞的真正目的。
 
2-2-1 未染色样本切割

对样品（多为切片）进行染色就能够准确的判别自己所感兴趣的目的细胞，这样的做法保证了获取材料的均一性同质性，但染色过程难免会由于时间、染料、人为操作等多种因素造成样本的污染及破坏，这样采集的显微切割目标样本得出的结果就很让人质疑。那么如何取材才能获染色之利避损破之弊呢？

对组织进行连续切片操作，选中相邻三张切片中的一张进行染色及切割区域的选定（将其作为下一步激光在未染色切片上游走的坐标地图），然后软件将其作为模板，自动、准确地在将标记出的区域精准地整合在未染色的切片中并进行切割，其精准度不受切片的形状、铺片角度和位置的改变的影响，这样不但可避免染色对样本可能造成的影响，还节省了大量的时间和成本（图2-1）。

图2-1 对未染色样本切割

2-2-2  荧光标记筛选

有些实验需要对样品进行荧光标记，被抗体特异标记的细胞即为目的细胞，提升了获取均一细胞的精准性，系统提供的荧光模块，可以对免疫荧光组织及细胞进行选定切割（即将显微镜升级为荧光观测功能），其荧光通路完全独立于激光通路，系统的所有切割功能都不影响显微镜的独立正常使用。

2-2-3  软件识别（CellExplorer）

软件可根据设定的细胞大小、形态、荧光标记等自动识别、标记样品中的靶细胞，并给出建议的切割路径，并可对系统设定后的路径进行调整使路径更加精确（图2-2）。基于形态学及荧光标记等，让计算机智能的筛选出目的细胞。

图2-2 软件对细胞的识别

2-2-4 分类采集（Multi模块）

系统不但可以对一个样本中的不同类型细胞进行分别采集（图2-3 8连管适配器）；还可以对多个样本中的同一类细胞进行集中采集（图2-4位载玻片平台），极大地提高了采集的效率及准确性。其中对于不同类型细胞的一次性采集，可以用不同的颜色对不同类型细胞分别选择标记（图2-5，软件标记），软件会自动的识别并分别采集到不同的管内。

图2-3 MultCap模块

图2-4 MultiSlide 模块

图2-5 软件标记多种类型细胞

3 质检

系统可以实时监控整个分离过程，并得到分离前、分离后、分离下的样本的三张原位图片（图3-1），查看目标区域是否被切割，切割区是否正确及切割下来的样本是否完整的被采集管所采集回收；这样的功能就确保了每一步操作的实效性，同时黏附采集方式又大大提升样本的回收率，两者合二为一则可使系统保质保量的完成切割任务。

图3-1 分离前、后、下的样本原位图

4 量控

PTP（Predefined Target Positioning）技术是把黏性管盖分成若干个区域来对样本进行黏附采集，合理有效地利用了黏附管盖的有限空间，提高样本的收集效率同时也节省了成本；所分离的细胞可以整齐地分布排列于管盖上（图4-1），这样可以对所采集的细胞数目进行严格的控制，给予采集细胞样本以准确的数量而不是一味的用“若干”来描述样本量，起到采集定量的作用，对下游的核酸及蛋白等分子的定量分析提供相对准确的样本量输出。就因为有了PTP技术，质控才实现其真正的意义，而对于其他品牌的质控就显得形同虚设，质控的前提是保证在样本切割前、后、下三个阶段的图像上有所对应的关系，随机的黏附或采集所获得的图像来做质检便是毫无意义的，其一，无法保证所获取的样本无重叠的排布以供清晰成像质检；其二，即使可以做到无重叠的采集样本，那么样本的三个图片也无法一一对应，更不用谈什么质控。统可以实时监控整个分离过程，并得到分离前、分离后、分离下的样本的三张原位图片，查看目标区域是否被切割，切割区是否正确及切割下来的样本是否完整的被采集管所采集回收；这样的功能就确保了每一步操作的实效性，同时黏附采集方式又大大提升样本的回收率，两者合二为一则可使系统保质保量的完成切割任务。

图4-1 PTP技术 管盖区域划分图

5 触屏操作
 
系统在软件设计方面更加注重与硬件的融合及产品与使用者间的交流，触屏划取切割区域使操作更加方便直观（图5-1），避免了鼠标划取的不精确性所造成的误差，高清晰的成像，精细的切割路线，恒定不变形的激光光斑，这些都保证了切割的精准性，此时唯独需要的就是我们画出准确的目的区域，那么触屏操作便是促使切割成功的*后一阵东风，让每一步都接近完美，获得*优化的实验输出。

图5-1  触屏操作

6 活细胞切割

设计精巧的套皿专门用于活细胞的切割，内皿的底面是膜，可以进行细胞培养（为了增加分离膜的粘性，同时情结分离膜，可以使用紫外光照射分离膜，也可以对膜进行多聚赖氨酸处理来增强细胞的粘附生长），内皿放置与大皿中，培养后的贴壁活细胞再经过染色、荧光标记等手段进行标记，然后激光切割目的细胞，将内皿取出后，目的细胞便留在了大皿中，可进行直接刮去收集，或加入培养基进行继续培养(见流程图3-1)。

7 纳升级液体吸取量

CellEctor毛细管由软件操控，吸取、吹出的液体体积可精确至2nl，精细细地完成悬浮单细胞的吸取及转移；毛细管还可进行180度翻转完成贴壁细胞的刮取（图7-1）。

3D机械臂CellRobot机械臂可以沿着X/Y/Z三个轴向进行任意调控毛细管的位置，并且可调整倾斜角度进行自由的旋转（图7-2），使其对于细胞的挑选过程中的更具灵活性。

图7-1 毛细管的吸取及刮取

图7-2 3D CellRobot

总结

无论是切片的中组织内单个细胞，涂片中的单个细胞，还是体外培养的贴壁活细胞抑或悬浮细胞，对于这套MMi单细胞获取自动化工作站来说都可精确无误地手到擒来、众里挑一，提高实验对象的均一性及特异性。而单细胞是细胞均一化的极致，对生命活动*基本的单位个体进行研究，来发掘生命活动之奥秘已成为生命科学研究的不可忽视的手段之一，MMi应生物学发展之潮流，推出的单细胞获取工作站无疑是为研究者提供在单细胞实验中*完美的装备。

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