如何为甲基化特异PCR设计引物[心得点评]

在甲基化特异PCR分析中，引物设计很关键。据约翰霍普金斯医院的肿瘤学教授James Gordon Herman介绍，大部分人都是栽在这一步。Herman可不是别人。他1996年在PNAS上发文，首次引入这一技术。以下是Herman关于MSP引物设计的一些建议。

在甲基化研究中，研究人员常常利用甲基化特异PCR（MSP）来拷问CpG岛内特定序列的甲基化状态。这是一种快速经济的方法，只要有PCR仪的实验室都能开展。原理也很简单。首先，利用亚硫酸氢钠将未甲基化的胞嘧啶脱氨基，将其转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。随后对处理过的DNA开展两个PCR反应。一个反应利用U引物对来扩增原先未甲基化的模板；而另一个反应则利用M引物对来扩增原先甲基化的模板。

这一研究中，引物设计很关键。据约翰霍普金斯医院的肿瘤学教授James Gordon Herman介绍，大部分人都是栽在这一步。Herman可不是别人。他1996年在PNAS上发文，首次引入这一技术。以下是Herman关于MSP引物设计的一些建议。

为亚硫酸氢盐转化的模板设计引物

不要先设计引物，然后再转化它们。这听上去理所当然，但你需要记住，当C转化成U时，DNA链不再互补。Herman谈道：“为正义链设计的引物不同于反义链。很多人在画出来之后才明白这一点。”

确保目标序列中有非CpG的C

Herman认为，目标序列中应有非CpG的C，因为它们不会被甲基化。“如果你没有足够的C位于非CpG内，那么未转化的DNA和甲基化的DNA看上去会差不多。”

以6-7个CpG为目标

Herman在这些年开展了大约5000个MSP。他发现，与基因表达和基因沉默相关的是两个引物之间的4-8个CpG，以6-7个最为理想。如果低于这个，那么特异性会降低。你会得到非特异性的扩增，因为它区分度不够。

让目标短一点

亚硫酸氢盐转化的过程会损伤模板DNA，因此尝试扩增较小的片段（小于150 bp），将得到最佳的结果。如果你通过电泳来运行产物，那么确保你能够将M引物的产物与U引物的分开。若你开展实时定量研究，要在引物之间留出探针的位置。

遵守PCR的原则

PCR引物设计的所有原则也适用于MSP。例如，引物的退火温度要相当，引物之间不要形成二聚体，是目标序列特异的。如果可以的话，将M引物和U引物设计成相同的条件，这样可同时运行。此外，还有一些需要注意。将胞嘧啶转化成尿嘧啶，会降低复杂度，也降低退火温度，这意味着MSP通常需要更长的引物，来实现相同的特异性。

使用适当的程序

PCR引物当然可以手动设计，但考虑到MSP的复杂性，有软件帮忙当然会轻松很多。Herman的实验室开发出一款名为MSPprimer的应用程序，可专门为MSP设计引物。MSPprimer融入了标准PCR的考虑因素，以及亚硫酸氢盐特异性，确保你不会扩增未转化的DNA。同时它还具有甲基化特异性，确保你真正区分甲基化和未甲基化的CpG。

研究人员通常会研究CpG岛的甲基化状态，因为它与基因功能相关。如果在某种疾病状态下有个基因严重甲基化，那么说明此基因有可能参与了疾病发展。因此，Herman的最后一个建议是关注对生物学很关键的区域。“你可以设计任何区域的引物，但如果它不能调控基因功能或基因表达，那似乎意义不大。”（生物通 薄荷）

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