-
生物通官微
陪你抓住生命科技
跳动的脉搏
两种畅销miRNA定量分析的比较[心得点评]
【字体: 大 中 小 】 时间:2013年04月02日 来源:生物通
编辑推荐:
英国LGC有限公司的研究人员比较了市场上两种畅销的microRNA(miRNA)定量PCR分析,Life Technologies的Taqman miRNA Assay和Exiqon的miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR assay,并评估了小RNA富集方法对qPCR分析的影响。该成果近日发表在《BioTechniques》杂志上。
生物通报道 英国LGC有限公司的研究人员比较了市场上两种畅销的microRNA(miRNA)定量PCR分析,Life Technologies的Taqman miRNA Assay和Exiqon的miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR assay,并评估了小RNA富集方法对qPCR分析的影响。该成果近日发表在《BioTechniques》杂志上。
miRNA这种非编码RNA分子调控了多个生物学过程,包括细胞命运决定、细胞增殖、细胞分化和细胞死亡。因miRNA稳定性高和细胞/组织特异性,人们对其临床应用的兴趣日益增加。此外,血液中循环miRNA的发现更是刺激了大量研究,了解其是否能作为疾病的生物标志物。
目前有多种技术可定量miRNA的表达,但RT-qPCR因其灵敏度和特异性,被认为是金标准。市场上多家公司提供miRNA RT-qPCR分析,它们采用不同的方法,来实现miRNA的准确定量。之前的研究虽有介绍过这些方法,但并未从实验上全面比较。同时,样品制备过程对下游miRNA定量的影响也并未引起太多关注。
此外,miRNA研究领域还有一个急需解决的问题,就是miRNA数据的标准化。一般来说,miRNA图谱分析包含一系列步骤,它们对技术操作高度敏感。因此,需要一种方法来标准化各个步骤,便于平台内部或平台之间的比较。
在这项研究中,来自LGC有限公司的研究人员比较了市场上两种畅销的miRNA RT-qPCR分析,Life Technologies的Taqman miRNA Assay和Exiqon的miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR assay,并评估了小RNA富集方法对RT-qPCR分析的影响。此外,他们还研究了拟南芥miRNA标准品作为实验过程的对照。
Taqman miRNA Assay是利用miRNA特异的茎环逆转录引物来产生cDNA,随后用水解探针进行qPCR扩增。而miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR assay是对成熟miRNA加上poly(A)尾巴,随后利用poly(T)逆转录引物产生cDNA,再利用miRNA特异的正向和反向引物进行qPCR扩增。
研究人员在比较后发现,这两种技术在分析效率上相似,但Exiqon分析的变化似乎略大一些。对于某些miRNA,尽管使用相同的标准曲线,但两种分析技术产生了明显不同的拷贝数估计,这表明RT-qPCR技术对miRNA的测定有显著影响。而拟南芥加标可作为有用的对照,来评估技术灵敏度,因为它们有着已知的拷贝数,与人miRNA不表现出明显的交叉反应性。
此外,就富集过程和RT-qPCR的影响而言,拟南芥miRNA与内源人miRNA有着相似的性能特征。由于miRNA图谱分析通常包含一系列步骤,拟南芥加标miRNA提供了一种可靠的方法,便于平台内或平台间的比较。研究人员还发现,在比较相当量的总RNA和富集材料时,总RNA材料的小RNA富集会导致miRNA信号减少4倍。因此,来自总RNA和小RNA的miRNA数据也许不能直接比较。(生物通 薄荷)
原文检索
A comparison of miRNA isolation and RT-qPCR technologies and their effects on quantification accuracy and repeatability
BioTechniques, Vol. 54, No. 3, March 2013, pp. 155–164