分光光度计的使用技巧[心得点评]

【字体: 时间:2013年04月08日 来源:生物通

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  分光光度计是生物学实验室不可或缺的好伙伴。它常用来测定生物样品中的核酸、蛋白和细胞。这些样品要么体积有限,要么浓度很高,为分光光度法测定带来了一定挑战。当然,技术在不断发展,让微量样品的测定成为现实。在分光光度计的使用过程中,有哪些需要注意的呢?让专家来告诉你。

分光光度计是生物学实验室不可或缺的好伙伴。它常用来测定生物样品中的核酸、蛋白和细胞。这些样品要么体积有限,要么浓度很高,为分光光度法测定带来了一定挑战。当然,技术在不断发展,让微量样品的测定成为现实。在分光光度计的使用过程中,有哪些需要注意的呢?让专家来告诉你。

据介绍,分光光度计使用过程中的最大问题往往在于用户选择了错误的方法或错误的比色皿。而另一个问题在于纯化的策略不对。用户应正确选择分光光度计,并注意下面的一些问题。

低体积 vs. 低浓度

我们首先要了解样品的特性。有时,我们可能会混淆低体积和低浓度,产生有问题的数据。这时,我们有必要回忆一下比尔-朗伯定律:当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收介质的厚度l成正比。根据这一定律,当吸收介质厚度不变时,A与c之间应该成正比。而对于高浓度的样品,应使用较短的光程长度进行测定。

样品纯度

样品纯度很重要,这不仅仅关乎分光光度法测定,也涉及到其他的下游应用。样品中的杂质可能包括蛋白、缓冲液组分,甚至细胞。你应当根据样品量和浓度来选择样品制备策略。各大厂家都提供选择指南和操作手册,教你如何选择最适合的产品。此外,要避免过滤柱的过载,以免产生不纯的样品洗脱液。

选择适当的比色皿

比色皿是光学透明的容器,装有分析溶液,将样品引入光路中。分析波长在350 nm以上时,可选用玻璃或石英比色皿,在350 nm以下时须使用石英比色皿,当然,现在也有一次性的塑料比色皿。有些比色皿提供不同的光程长度,如Eppendorf的UVettes。它提供两种不同的透光光径:10 mm和2 mm。通常浓度的样品可以用10 mm光程长度进行检测。对于高浓度的样品,只需将比色皿旋转90°,使用稍短的2 mm光径进行检测。

在使用前一定要仔细检查比色皿,如果有刮花或油污,或者上面有指纹,都会导致不准确的测定结果。目前市场上的有些分光光度计很灵活,可以容纳多种比色皿,包括微量比色皿。这些微量比色皿使用微量的高浓度样品,特别适合生物分子(如核酸和蛋白)的测定。有些分光光度计是直接把样品放在测量窗口上,也十分方便。

软件要求

没人想把时间花在仪器培训上。因此,在您选择分光光度计时,简单易用也是个重要的考量因素。即拆即用,这当然是最美了。数据管理和存储也应当考虑。在有些情况下,电源中断或系统故障会导致数据损失。如今有些仪器能直接连到电脑,而不需要额外的软件或存储设备。

随着技术的发展,专为生物学应用而开发的分光光度计在不断涌现。相信我们的选择会越来越多,而仪器使用也会越来越简单、方便、灵活。(生物通 薄荷)

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