掌握western blotting的“膜”力[心得点评]

【字体: 时间:2013年05月24日 来源:生物通

编辑推荐:

  成功的实验都是相似的,不成功的实验则各有各的不幸。说起Western blotting,原理虽然简单,但个中甜酸苦辣,只有自己才知道。对于成功的Western blotting而言,关键因素有很多:一抗、二抗、转印、显色。膜,却往往被忽略,常常是,别人用什么,我也用什么;实验室有什么,我就用什么。

成功的实验都是相似的,不成功的实验则各有各的不幸。说起Western blotting,原理虽然简单,但个中甜酸苦辣,只有自己才知道。对于成功的Western blotting而言,关键因素有很多:一抗、二抗、转印、显色。膜,却往往被忽略,常常是,别人用什么,我也用什么;实验室有什么,我就用什么。但每个人的研究对象不同,适合别人的未必适合你。

在选择膜时,我们要考虑两个关键因素:膜的类型和孔径大小。在你决定了这两个因素后,你还可以选择膜的形式等。Bio-Rad公司实验室分离部门的全球产品经理Thomas Davies是这方面的专家,他提出了一些建议。

PVDF vs. NC

让我们先来看看Western blotting中最常用的两种膜:PVDF膜和硝酸纤维素(NC)膜。每一种膜的性质不同,也适合不同的实验条件。让我们先来看看每一种膜的物理性质和性能特点吧。

PVDF膜之所以如此受人欢迎,是因为它具有几个关键特性。首先,它带来了高的机械强度和耐化学腐蚀性,因此适合反复使用(reprobing)。同时,PVDF膜也比NC膜具有更高的结合能力,150-160 µg/cm2 vs. 80 µg/cm2,这意味着它提供了更高的灵敏度。

由于PVDF的疏水性,这些膜也成为疏水蛋白质(如膜蛋白)的首选。也正因为如此,这种膜需要一个简短的甲醇“润湿”步骤。如果你在荧光blot中选择PVDF,那么须选择一种低荧光的PVDF膜,它与标准PVDF膜的特性相同,但自发荧光极低。

硝酸纤维素膜一度是Western blotting中的首选,现在也颇受欢迎,因为蛋白与硝酸纤维素的结合是瞬时的,几乎不可逆转,而膜很容易水化。

传统的硝酸纤维素膜不适合反复使用,也不耐受剧烈的化学处理。对于这些情况,支持的硝酸纤维素膜是个更好的选择。它包含了惰性的支持结构,增强膜的强度和韧性。

孔径大小

选择膜时的第二个考虑是孔径大小。Western blotting的膜是微孔基质,可与蛋白结合;孔的大小决定了哪些蛋白会成功结合,而哪些蛋白会穿过。

Western blotting的膜通常有两个孔径大小。对于大部分实验,0.45 µm的膜是不错的选择,它适合分子量高于20 kD的蛋白;而0.2 µm的膜更适合小于15 kD的低分子量蛋白。记住一个原则:如果检测上样量低的蛋白,或是定量检测,那么宁小勿大。

形式

目前市场上有多种包装形式的膜,让人眼花缭乱。在选择这些膜时,你必须考虑到转印系统(半干、湿转)、方便性以及价格等。

• 一大卷,这是最受欢迎的形式,因为膜的面积很大(如26 cm x 3.3 m),经济实惠。你可以根据凝胶的大小来切割,相当灵活。当然,这需要花费一些时间,也会带来膜大小的差异。
• 预切膜,由制造商预先切好,省时省力,就是不省钱。很多公司提供各种大小的预切膜。
• 预切且预润湿的膜。如果高通量、方便性对你很重要,那么这种就是最佳之选。

Western blotting的确有很多不确定的因素,因为很难控制每个实验参数。控制好我们所能控制的,那就离成功又近了一步。(生物通 薄荷)

了解Bio-Rad的各种蛋白质印迹膜

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号