冷泉港实验方案教您如何制备RNA-Seq的文库

近日，冷泉港实验方案《Cold Spring Harbor Protocols》2013年5月刊发布。本期介绍了一些实用技术，如通过免疫抗体包被筛选法（Immunopanning）纯化大鼠和小鼠的星形胶质细胞，以及在Illumina转录组测序中，从Poly(A)+ mRNA制备mRNA-Seq文库的窍门。这两篇protocol都可免费阅读。

1. Tips for Preparing mRNA-Seq Libraries from Poly(A)+ mRNA for Illumina Transcriptome High-Throughput Sequencing

这篇Protocol改编自《RNA: A Laboratory Manual》一书，作者是Brenton R. Graveley。许多开展mRNA高通量测序（mRNA-Seq）的研究人员都使用Illumina的文库制备试剂盒。在此，作者介绍了一些背景知识、窍门，以及troubleshooting的建议。

对基因表达谱分析而言，从Poly(A)+ mRNA制备cDNA文库并开展高通量测序正成为一种常规方法。目前有几种不同的方法可产生cDNA文库。最好的方法之一是利用金属离子介导的裂解将mRNA片段化，接着进行随机引物化的cDNA合成。

作者提到，对RNA-Seq而言，我们在决定如何制备文库前，必须先考虑实验目的。例如，短读取通常足以开展基因表达分析。相比之下，更深度覆盖和更长的末端配对读取才能明显提高选择性剪接事件的检测能力。而更大的深度也有助于稀有RNA的发现。此外，作者还介绍了一些开始前的注意事项，以及实验窍门和troubleshooting，值得开展RNA-Seq的研究人员一读。

2. Purification of Rat and Mouse Astrocytes by Immunopanning

这篇Protocol是由斯坦福大学医学院神经生物学系的Lynette C. Foo提供的。作者介绍了如何使用免疫抗体包被筛选法（Immunopanning）来纯化啮齿动物的星形胶质细胞。

星形胶质细胞的免疫抗体包被筛选实现了星形胶质细胞与啮齿动物大脑的分离。这种方法可直接分离细胞，而不需要多个步骤，从而允许有代表性星形胶质细胞的选择。免疫抗体包被筛选是一个非常温和的过程，细胞在制备后依然存活，可在包含肝素结合性表皮生长因子（HBEGF）的无血清培养基中生长至少2周。这一protocol最初是在大鼠中建立和验证的，但略经修改，也可用于小鼠细胞的纯化，本文亦有介绍。

（生物通 余亮）