让ChIP成功开展的四个建议[心得点评]

【字体: 时间:2013年07月30日 来源:生物通

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  染色质免疫沉淀(ChIP)是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。虽然ChIP技术的原理不复杂,但是对技术的要求高,实验步骤的设计摸索耗时耗力,实验耗费时间长。也许您从未开展过ChIP,也许您的ChIP结果有待改善,那么,听一听专家的建议吧。

染色质免疫沉淀(ChIP)是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。虽然ChIP技术的原理不复杂,但是对技术的要求高,实验步骤的设计摸索耗时耗力,实验耗费时间长。也许您从未开展过ChIP,也许您的ChIP结果有待改善,那么,听一听专家的建议吧。

是否需要交联?

交联的目的是将感兴趣的抗原固定在其染色质结合位点。若没有交联的步骤,就意味着只有与染色质结合非常紧密的蛋白质能被免疫沉淀,譬如组蛋白。若您的研究对象是组蛋白,那可能不需要交联,而其他蛋白,如转录因子和DNA结合复合物中包含的蛋白,可能还需要交联。如果使用交联,则ChIP反应被称为X-ChIP,则天然的ChIP反应被称为N-ChIP。然而,确实有一些抗原不适合用X-ChIP这种方式,因为在交联过程中它们的表型会发生变化,或出现包涵体。

片段化要小心

染色质必须片段化,才能让相互反应接触到抗体。无论您采用哪种方法,都必须确保一定的片段化时间进程。对于X-ChIP,超声波处理是必需的,因为甲醛交联限制了酶切的效果。超声波处理的条件要自己来优化,不过说明书上通常都会给出一个参考条件。超声波产生了随机的DNA片段(平均500-700 bp)。在开展N-ChIP时,微球菌核酸酶的消化可产生~175 bp的单体。酶切消化的优势在于消化的重复性好,易控制反应。

抗体用对没有?

如果可以的话,使用经过充分验证、ChIP级别的抗体。当然,这种抗体并不多。如果没有,也可以选择普通的免疫沉淀抗体,或能够识别天然表位的抗体。一般来说,多克隆抗体是个更好的选择,因为单克隆抗体只识别单个表位,而这个表位有可能在交联过程中被掩盖。而另一方面,单克隆抗体却往往有着更好的批间一致性。抗体的量和使用的条件都应根据使用经验来确定。一般情况下可以从每50ug DNA使用2-5ug抗体作为起始条件开始摸索。

对照也很重要

作为ChIP技术的阳性对照,H3K4me3和H3K9me3分别适用于激活和失活的基因。作为阴性对照,可选择一个识别非染色质表位的抗体,如GFP抗体。但要记住,这些抗体本身不是阳性和阴性对照,因为这取决于您正在研究的位点。如果在您研究的位点无H3K4me3,即使是最好的ChIP级别的H3K4me3抗体也不能让任何东西免疫沉淀,那么这就不是一个理想的阳性对照。如果您的实验室刚刚开始用ChIP,最好考虑购买试剂盒。(生物通 薄荷)

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