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扫清ChIP实验的技术障碍[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2013年9月17日 来源:生物通

摘要:

  ChIP涉及到一系列蛋白质组学和分子生物学的方法,包括交联、细胞裂解、核酸剪切、基于抗体的免疫沉淀、DNA样品的纯化以及qPCR等分析。实验从原理上说虽很简单,但要想成功,却并不容易。下面就让我们一起来扫清ChIP实验的技术障碍吧。

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基因表达的控制从根本上来说是蛋白-DNA的相互作用。这些相互作用可通过生化分析轻松地弄清,如凝胶阻滞分析。但如果研究人员想知道基因组DNA的特定部分是否参与,通常会选择染色质免疫沉淀技术(ChIP)。

ChIP是在全基因组范围内识别DNA与蛋白质相互作用的标准方法,最初用于组蛋白修饰研究,后来也用于转录因子。整个实验涉及到一系列蛋白质组学和分子生物学的方法,包括交联、细胞裂解、核酸剪切、基于抗体的免疫沉淀、DNA样品的纯化以及qPCR等分析。实验从原理上说虽很简单,但要想成功,却并不容易。下面就让我们一起来扫清ChIP实验的技术障碍吧。

第1步:交联


 
(图片来自Pierce,下同)

ChIP分析是从蛋白-DNA复合物的共价稳定开始的。许多蛋白-DNA的相互作用是瞬时的,涉及到多个蛋白复合物。体内(in vivo)的交联稳定了蛋白-DNA复合物。若没有交联的步骤,则意味着只有与染色质结合非常紧密的蛋白才能被免疫沉淀,譬如组蛋白。若您的研究对象是组蛋白,那可能不需要交联,而其他蛋白(如转录因子)还是需要交联。

如果使用交联,则ChIP反应被称为X-ChIP,而天然的ChIP反应被称为N-ChIP。然而,确实有一些抗原不适合用X-ChIP这种方式,因为在交联过程中它们的表型会发生变化,或出现包涵体。

体内交联通常是利用甲醛来实现的,但也可以与其他的交联剂(如EGS和DSG)结合使用。甲醛交联适用于两个直接相互作用的分子。然而,甲醛是零长度(zero-length)的交联剂,这限制了其功能。对于更复杂的相互作用,我们可以选用更长的交联剂,如EGS(16.1埃)或DSG(7.7埃),以便捕获更大的蛋白复合物。

第2步:细胞裂解

裂解过程从细胞或组织中提取出交联的蛋白-DNA复合物,让它们进入溶液。在这一阶段,通过去污剂溶液来溶解细胞膜,从而释放细胞组分。蛋白-DNA相互作用主要发生在核内,故去除胞浆蛋白可降低背景,并提高灵敏度。去污剂或盐的存在不会影响蛋白-DNA复合物,因此上一步中实现的共价交联将在整个ChIP过程中保持复合物稳定。

一般不建议使用机械裂解,因为细胞核裂解的效率不高。我们可使用一些试剂将细胞核与其他细胞组分分离,从而消除背景信号,提高灵敏度,比如Pierce Chromatin Prep Module。

第3步:染色质制备(剪切/消化)

为了分析与蛋白结合的序列,所提取出的基因组DNA必须剪切成更小的片段。DNA片段化通常是利用超声波处理或微球菌(MNase)的酶切消化来实现的。

理想的染色质片段在200至>1000 bp,但DNA剪切是最难控制的步骤之一。对于X-ChIP,超声波处理是必需的,因为甲醛交联限制了酶切的效果。超声波处理带来了真正随机的片段,但需要使用专门的仪器,也有一些限制,包括需要优化、在处理过程中难以维持温度。微球菌消化的重复性好,可处理多个样品,但酶活也可能存在差异。

第4步:免疫沉淀

为了分离特定修饰的组蛋白、转录因子或辅助因子,我们需要使用ChIP级别的抗体来进行免疫沉淀,并从其他核组分中分离目标。这一步选择性富集蛋白-DNA复合物,并去除其他无关的细胞组分。

人人都说,抗体的正确选择是ChIP分析成功的一个关键因素,因此这一步可不能掉以轻心。市场上的抗体很多,但并非每一个都适合ChIP,这主要取决于抗体识别哪个表位。例如,有些抗体在三维背景下识别它们的抗原,而另外一些只能识别变性蛋白。对于后者,它们可能适合Western blot,而不是ChIP。

许多公司提供ChIP级别的抗体。赛默飞世尔旗下的Pierce大约提供100多种经ChIP验证过的抗体。默克密理博也提供近90种ChIPAb+™抗体。据介绍,ChIPAb+™抗体每一批、每一次都经过染色质免疫沉淀的验证。它们经过已知阳性和阴性位点的验证,并带有配对的IgG阴性对照和PCR引物。对于ChIP新手而言,ChIPAb+ 显然是再适合不过了。

了解ChIPAb+抗体及试剂盒的更多信息

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