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NanoDrop在蛋白检测中的应用专题1[创新技巧]
蛋白检测的常用方法
【字体: 大 中 小 】 时间:2014年01月15日 来源:
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比色法如新Pierce 660,BCA,Bradford,lowry法等常用于检测不明蛋白溶液和细胞裂解液。而蛋白质中含有的色氨酸、酪氨酸残基或半胱氨酸二硫键可以吸收紫外光(280nm)的特性,使吸收光谱法即通过测蛋白280nm吸光值的方法成为一种快速的、方便的进行纯蛋白定量的方法。
下表是用Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c分光光度计操作软件进行蛋白检测的实用指南。比色法如新Pierce 660,BCA,Bradford,lowry法等常用于检测不明蛋白溶液和细胞裂解液。而蛋白质中含有的色氨酸、酪氨酸残基或半胱氨酸二硫键可以吸收紫外光(280nm)的特性,使吸收光谱法即通过测蛋白280nm吸光值的方法成为一种快速的、方便的进行纯蛋白定量的方法。
方法 *低检测下限 大约的检测上限 方法的优势 方法的劣势 方法类型/计算方法 Pierce 660 nm (试剂和样本的体积比:15:1 ) ********** 25 ug/mL (试剂和样本的体积比:7.5:1 ) 2000 ug/mL ********** 1000 ug/mL *快速,*简单,且在所有蛋白检测方法中*精确。可兼容Laemmli上样缓冲液、各种洗涤剂和还原剂。室温保存和使用 不同的蛋白样本之间会有差异,但是是比Bradford更好的选择。 比色法/需要标准曲线 BCA 0.2 mg/mL (试剂和样本的体积比:20:1 ) ********** 0.01 mg/mL (试剂和样本的体积比:1:1 ) 8 mg/mL ********** 0.2 mg/mL 可兼容多种表面活性剂(浓度可高达5%)。与Bradford相比,不同蛋白样本间的差异更小 铜螯合物,还原剂和高缓冲能力的溶液可能产生干扰。 比色法/需要标准曲线 100 ug/mL (试剂和样本的体积比:50:1) ********** 15 ug/ml (试剂和样本的体积比:1:1) 8000 ug/mL ********** 100 ug/mL 快速且简单,在室温下便可操作。 可能与表面活性剂形成沉淀,不同的蛋白样本之间差异是BCA法的两倍。 比色法/需要标准曲线 Modified Lowry 0.2 mg/mL 4.0 mg/mL 可以利用650 ~750 nm之间任何一个波长来进行检测,仅有很小的色度损失 *佳的检测波长为750 nm,因为很少有杂质在这个波长下会有光吸收 洗涤剂和钾离子会和Modified Lowry实验形成沉淀;螯合剂,还原剂和自由硫醇都会对该实验产生干扰。 比色法/需要标准曲线 A280 0.10 mg/mL (基座检测纯化的BSA) 0.010 mg/mL (比色杯检测纯化的BSA) 400 mg/mL (纯化的BSA) 快速,无需加入任何试剂,也无 需其他前期的操作和预处理;无需建立标准曲线。 未知的蛋白样本和混合蛋白用该方法检测蛋白尤其是不明蛋白或蛋白混合物,误差可能会非常大;任何吸收紫外光的非蛋白成分(如核酸,不溶性细胞裂解物等)都可能多实验造成干扰 吸收值和比尔—朗伯定律的吸收光&朗伯比尔定律计算/无需标准曲线
比色法检测蛋白:
• Pierce 660 nm 蛋白检测法的特点是:比Bradford 法有更宽的线性范围。只需一种mix试剂和实验步骤,无需很长的孵育时间,试剂在室温保存即可。该方法还可兼容常见的洗涤剂和还原剂,包括含有Laemmli缓冲液(含溴芬蓝)并添加IDCR(兼容离子型去垢剂)至终浓度为50mM的样品的蛋白样本。
• BCA (Bicinchoninic Acid) 蛋白检测法常用于检测非常稀的蛋白样本或/和有分在紫外光(280nm)下有明显吸收的蛋白样本。在蛋白存在下形成的Cu-BCA螯合物在562 nm有*大吸收峰(750nm校准)
• Bradford 蛋白检测法 考马斯亮蓝染色的蛋白其吸光峰会转移到595 nm,利用这一特性进行蛋白浓度检测。稳定、商品化的反应试剂含考马斯亮蓝,乙醇和表面活性剂,多家试剂生产商都有供应。但蛋白的氨基酸成分对结果的检测有很大影响。该方法对非蛋白物质尤其是洗涤剂也很敏感,并且检测高浓度蛋白时就不成线性了。
• Modified Lowry蛋白检测法是基于广泛使用和引用的Lowry 法进行蛋白定量。改进的Lowry法的原理是:在碱性溶液,硫酸铜会与蛋白反应,形成铜-蛋白复合物,该复合物被Folin-Ciocalteu还原,形成蓝色的水溶性产物,该物质在650 nm处有*大吸收峰(405nm校准)。
比色法所用的预制试剂可从特定的生产商购买,请参阅厂家推荐的试剂生产商。Thermo Fisher Scientific提供蛋白标准品,稀释的标准品和蛋白纯化产品,详见网址: http://www.piercenet.com.
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吸收光检测蛋白:
•在NanoDrop™ 2000/2000c 操作软件中的 Protein A280 检测模块是用于判定纯蛋白样本的浓度。利用比尔—朗伯定律的公式(A = E * b * c )将吸收值换算成浓度:
A 为吸收值 (A),
E 为该波长下的摩尔吸光系数(摩尔消光系数),单位是L/mol-cm
b 为光路径(cm)
c 为样本浓度(mol/L或M )
软件提供了6种消光系数的选择,以便通过比尔—朗伯定律的公式来计算样本的浓度:
• Proteins & Labels 是另一项应用,用来检测在蛋白芯片实验中,纯蛋白的浓度(A280 nm) 和荧光染料的浓度,来质控荧光染料的标记效率。这项应用中有同样的6种蛋白样本供选择,也是通过朗伯—比尔定律进行蛋白浓度的计算。荧光染料浓度是通过朗伯—比尔定律和Dye/Chromophore表中的信息来计算的。Proteins & Labels还可以利用波长比率来检测纯金属蛋白(比如血红蛋白)。
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