专家经验谈:把支原体赶出去

【字体: 时间:2014年01月06日 来源:生物通

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  为了帮助大家将这个恼人的小东西赶出实验室,The Scientist杂志针对支原体污染的预防、检测和处理,咨询了多位专家的意见。

生物通报道:无处不在的支原体,可进行自我复制,是能独立生存的最小生物。上世纪五十年代,人们首次从体外培养的细胞中分离到了支原体。从那以后人们发现,57–92%的培养细胞都受到了支原体的污染。由于缺乏细胞壁,支原体能抵抗常用的抗生素(例如链霉素和青霉素),而且它们也能很轻易的通过过滤装置。

现在,研究者们已经在小心防范支原体的污染,但仍有约35%的体外培养细胞受到影响。由于常规显微镜无法检测到这些微生物,支原体污染逐渐成为一个普遍存在的问题。这一问题在大学实验室尤为严重,因为这些实验室人员流动性大,细胞系频繁换人接手。

支原体能够对真核细胞产生间接的微妙影响。哈佛医学院的神经科学副教授Bakhos Tannous,多年前就曾领教过支原体污染的利害,因此在他的实验室中支原体检测已成常规。然而他惊讶的发现,支原体还是出现了。

研究人员在细胞培养基中,使用生物发光的报告蛋白进行研究,结果发现报告蛋白发生了降解。“只有受到支原体污染的细胞,其培养基中的Gaussia萤光素酶水平降低,”Tannous说。支原体通过某种未知的方式,使报告蛋白发生了变性。

研究人员在此基础上,开发了检测常见支原体菌株的新方法。研究显示,它比目前市面上的生物发光试剂盒灵敏100倍,成本也便宜得多。(Anal Chem, 84:4227-32, 2012)“这完全是偶然的发现,” Tannous说。

不过,并不是人人都能这么幸运的。为了帮助大家将这个恼人的小东西赶出实验室,The Scientist杂志针对支原体污染的预防、检测和处理,咨询了多位专家的意见。

防患于未然

对新获得的细胞系进行隔离测试,这一点非常重要。除非是来自非常可靠的著名细胞库,新细胞系和任何复苏的细胞应该被隔离至少两周并接受支原体检测,然后再进行日常培养。许多实验室并没有用来隔离细胞的单独培养箱。在这种情况下,可以将细胞培养瓶放在培养箱的另一侧或另一层,北卡罗莱纳州立大学主管细胞培养的Debora Esposito说。

在操作细胞时沉默是金,这是因为人类口腔含有一些容易造成污染的支原体,例如M. oraleM. fermentans、和M. hominis。在超净工作台上聊天、吹口哨或者唱歌都是不可取的,“如果你需要讨论,那么离细胞培养设施远一点。这样有助于避免包括支原体在内的污染。”

有些支原体污染源容易受到忽视,例如水浴槽、液氮、血清、滋养层细胞等等。支原体甚至能够在枪头的干燥内壁生存,生物制药公司的顾问Barbara Potts说,他负责控制支原体和其他污染。尽管支原体大小在0.1–0.5 μm之间,但“0.1 μm的过滤装置并不能解决污染问题,”她补充道。因为支原体的形态可以发生改变,轻松通过滤孔。

定期培训,保持操作者的责任感。实验室越大,在不同地方受训或工作过的人越多,越容易出现漏洞和疏忽。Esposito制定了标准的操作手册,并请操作者签名。她还推荐在细胞培养室挂上白色书写板,记录下不良操作。另外,她每两周会召开一次避免污染的实验室会议。

支原体的检测

支原体检测,应当成为细胞实验室的例行程序。除了良好的操作,定期检测是预防支原体污染的主要途径。那么,应该多久进行一次检测呢,专家们给出的答案并不一致,从每两周到每三周不等。Bionique Testing Laboratories公司的Jill Mariano指出,这个问题并没有固定答案,这取决于实验室的规模、细胞培养的时间、细胞的宝贵程度以及细胞的用途。同时培养多个细胞系的实验室,面临更大的交叉感染风险。

支原体会导致细胞死亡,不过更常见的情况是,支原体与细胞共同生存。支原体慢慢增殖,直至对细胞产生明显的影响。举例来说,支原体会干扰细胞迁移、信号传导、淋巴细胞活化和细胞因子表达。支原体污染能在不知不觉中改变许多参数,DSMZHans Drexler说。

研究者们往往选择通过PCR来检测最常见的支原体,因为PCR比基于细胞培养的方法更灵敏,出结果也更快。PCR法检测的是支原体核糖体RNA的保守序列,据Drexler介绍,引物和对照的选择非常关键。他与Cord Uphoff共同发表的PCR检测方案,只需要2-3小时就能出结果(Methods Mol Biol, 946:1-13, 2013)。

总的来说,专家推荐使用纯化的DNA进行PCR,而不是细胞裂解物。因为额外的DNA抽提步骤,能防止未知物质对PCR中的Taq酶产生干扰。Biologicals上发表的一个支原体PCR检测方案,就采用苯酚-氯仿法提取DNASep 23, 2013, DOI: 10.1016/j.biologicals.2013.08.005)。另外,一些商业化的支原体检测试剂盒,也能够帮你简化PCR(见下表)。


那些不熟悉PCR的研究者们,可以选择基于细胞培养的检测方法。例如,Tannous DIY的生物发光分析,筛选成本非常低,只不过需要用其他方法(如PCR)来验证支原体阳性的样本。InvivoGen公司的PlasmoTest试剂盒,提供的是基因工程细胞系,如果存在支原体细胞的培养基就会变色。该试剂盒的检测下限是150CFU/ mL,尽管这样的灵敏度赶不上PCR,但它的使用非常简便而且易于解读,InvivoGen公司的Scott Vara说。

如果条件允许,你还可以选择以荧光为基础的检测法,给支原体的DNA添加荧光标记,例如Life Technologies公司的MycoFluor试剂盒。该试剂盒售价$217 USD,含100个测试,每次需要样本2mLLife Technologies公司的Michael Brewer介绍到,MycoFluor的灵敏度取决于,测试的细胞类型、细胞碎片量和支原体种类。另外,还有公司为非专业人士提供技术服务(如Bionique公司)。只要提供样本,他们就能帮你进行荧光分析,。

现在,越来越多的学术实验室参与到细胞疗法的早期研发中来。Potts指出,这样的实验室可以考虑将样本送到符合相关规定的机构进行检验,例如BioniqueMicroSafe

污染的治理

是清除受到污染的细胞,还是慢慢对支原体进行处理,这个问题需要好好考量。在理想情况下,抗生素处理支原体需要两周时间。此外,细胞系还需要再培养两周,重新进行支原体检测,最后才能进入日常培养流程。不过,即使细胞接受了抗生素处理,支原体依然可能死灰复燃,Brewer说。

另外,别忘了及时建立备份。在开始抗生素处理之前,最好冷冻保存一些支原体阳性的细胞。如果抗生素处理不成功,或者抗生素杀死了细胞,冷冻保存的细胞就能派上用场,Drexler说。

抗生素处理可以多管齐下。InvivoGen公司的Plasmocin是常用的抗生素处理产品,主要针对支原体的DNA复制和蛋白合成。Drexler团队用Plasmocin处理58个受到支原体污染的细胞系,成功治愈了49个细胞系。对于剩余的9个细胞系,研究人员分别复苏了它们的备份,并用BaytrilBM-Cyclin, CiprobayMRAMycoZap进行了有效处理(J Biomed Biotechnol, 2012:267678, 2012)。当Plasmocin不能有效杀死支原体时,InvivoGen公司推荐将药物剂量增加50%,或者延长几个星期的处理时间。“支原体长的很慢,所以提高剂量的效果,可能不如延长处理时间好,”Vara说。

不过,抗生素的使用应有节制。一些研究者习惯在培养细胞时,预防性地使用抗生素。不过专家指出,抗生素的使用还是能免则免。因为抗生素不仅会引起支原体的抗性,“更重要的是,可能掩盖了持续存在的低水平污染,”使支原体污染情况更加复杂,难以排查出现问题的原因。

下表是市面上常见的一些支原体检测试剂盒:

试剂盒

方法

厂家

价格($

PlasmoTest

基因工程细胞系

invivogen

250个样本$431

MycoAlert

生物发光

lonza

100$707

MycoFluor

荧光

lifetechnologies

100个样本$217

MycoSEQ,带鉴定性阳性对照

rtPCR,SYBR Green

lifetechnologies

100个反应$2648

通用支原体检测试剂盒

PCR

atcc

40$325

PCR支原体检测试剂盒I/C

PCR

promokine

96$539

MycoQuick

PCR

systembio

96个反应$405

MycoProbe

PCR

rndsystems

96个反应$365

LookOut

PCR

sigmaaldrich

32个反应$238

Venor GeM

PCR

sigmaaldrich

25个反应$213

支原体PCR检测试剂盒(MYCO)

PCR

sciencellonline

100$364

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