这里可以走捷径,IHC优化小贴士

【字体: 时间:2014年10月23日 来源:生物通

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  IHC不只与一抗有关,缓冲液、抗原修复液和酶也是重要的变量。平衡这些变量是一件相当繁琐事,而本文介绍的一些小窍门可以帮你简化这一过程。

生物通报道:免疫组化(IHC)的原理是,根据抗体与抗原的特异结合来检测组织切片中的抗原(如蛋白)。词根immuno是指操作中所使用的抗体,而histo代表着组织。

利用特异的肿瘤标志物,医生们可以通过IHC诊断肿瘤是良性还是恶性,确定肿瘤的分期和分级,鉴别细胞类型和转移的来源。IHC也能用于药物开发,研究者们通过检测靶点的上调或下调来判断药物的疗效。

商业化的IHC抗体一般都提供有稀释和染色的建议,能为你节省许多摸索过程。然而,事情往往没那么简单。你的抗体可能没在IHC中验证过,或者你的样本并不标准,又或者实验就是不像文献或演示视频那样顺利,这时我们该怎么办呢?

IHC不只与一抗有关,还有缓冲液、抗原修复液和酶,”纽约大学Langone医学中心的IHC主管Luis Chiriboga说,“这些都是重要的变量。”平衡这些变量是一件相当繁琐事,而本文介绍的一些小窍门可以帮你简化这一过程。

首先要有信号

Chiriboga在教学生做IHC时总会说,生成信号是第一要务。“你必须先看到信号,才知道接下来要怎么做。” 一开始他通常使用较高的抗体浓度,在抗原表达水平不同的组织中进行测试,以便获得一个动态范围。

不过,调整信号就不只是抗体的问题了。“高品质抗体是第一要素。但如果用错了其它试剂,好抗体也会失败,”CST公司的Katherine Crosby说。

缓冲系统对一抗结合抗原的能力有着深远的影响。如果你用了抗体供应商推荐的试剂和方案但却没有看到理想的结果,就应该及时联系供应商的技术支持。如果你用的是经未测试的抗体,就有必要对pH或离子强度进行调节。

如果实验仍然检测不到组织里的抗原,但该抗原的确有表达,那么可能是抗原表位在固定过程中出了问题(比如被掩盖或变性)。在这种情况下,我们就需要对抗原进行修复。目前的抗原修复基本上是酶处理(比如pronasetrypsin)或者某种形式的加热,Sigma Aldrich公司的Lynn Stephenson说。

另外,我们还可以尝试不同的固定剂,用乙醇、甲醇甚至丙酮来取代福尔马林。“这些试剂会使抗原表位产生不同的改变,”Stephenson指出。

更好的标记体系

一般情况下,抗原识别只是整个过程的一部分。经典IHC方案是用二抗来识别一抗。二抗可以与辣根过氧化物酶(HRP)直接相连,不过更多情况是先用二抗连接生物素,然后用连有酶的链霉亲和素来进行识别。这样能形成一个多层次的信号放大系统。

“不过,这样的系统也可能带来更多的误差和背景,”Sigma Aldrich公司的Aaron Sin说。举例来说,亲和素可能识别内源生物素,尤其是在肝脏和肾脏这样的组织。(延伸阅读:攻克多重PCR之难

为此,许多研究者放弃了偶联生物素的二抗,开始使用一种以聚合物为基础的试剂。“它们相当于拖着一长串酶的二抗,”Vector Laboratories公司的Craig Pow说,该公司致力于生产蛋白标记和检测试剂。“这显然比使用HRP二抗要灵敏得多。”

Pow介绍,这种试剂的敏感度与生物素/亲和素差不多,但使用起来要简单得多,而且不用担心内源生物素产生的背景。如果需要更高的敏感度,还可以采用基于多级聚合物的试剂,比如Vector Laboratories最近推出的ImmPRESS™ Excel Amplified HRP Polymer Staining Kit

与酶体系相比,荧光体系能够更精确的定位抗体,甚至可以同时成像两个核抗原。不过,荧光成像的黑色背景不能提供常规显微镜那样的形态学结构。Sigma Aldrich公司的Duolink®系统有足够的敏感性和特异性,可以通过两个一抗检测邻近的抗原表位。

选择合适的颜色

IHC中最常用的酶是HRP和碱性磷酸酶(AP),不过它们的效果并非完全相同。HRP体系倾向于生成更密集的信号,“与AP相比能提供更细小更清晰的定位,”Pow说。但这并不是说AP就比HRP差,“实际上在某些应用中,正因为AP不那么稠密,反而能展现出更好的形态。”

这两种酶都有不同的生色底物,可以产生不同颜色的产物。“我们应当选择合适的颜色和复染剂,”Crosby说。

IHC远远不是把抗体放在组织切片上,然后用显微镜观察那么简单。要想得到实用、可靠而且清晰的结果,就需要耐心的对每一步进行优化。

 

Josh P. Roberts撰写/叶予编译)

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