《相约2015NSFC》之疾病相关miRNA研究策略

随着2015年的自然科学基金申请日期的日益临近，广大科研工作者将开始新一轮的基金申请准备工作。锐博生物根据当前医学生物领域的热门研究方向，将陆续推出一系列的研究方案，内容涵盖《疾病相关lncRNA研究策略》、《疾病相关miRNA研究策略》、《siRNA文库高通量筛选策略》、《疾病相关Exosome研究策略》、《中医药分子水平作用机制研究策略》等，为科研工作者的课题申请提供参考，敬请关注！

概览

miRNA是一类长度约19-22nt的非编码单链RNA分子（non-coding RNA molecules，ncRNAs）。在动物中，miRNA是比较保守的，哺乳动物的miRNA也会有不同亚型（旁系同源）。大多数miRNA基因都是作为单独的转录单位，位于其他基因比较远的区域。超过50%的miRNA基因都是成簇存在，通常会被转录为多顺反子形式的转录本。还有一小部分miRNA基因位于其他基因内部，与此基因拥有相同的转录起始位点，该基因也被称作miRNA的宿主基因。宿主基因可以是编码基因，也可以是非编码基因。当宿主基因为非编码基因时，基因内miRNA中约40%位于内含子区域，约10%位于外显子区；当宿主基因为编码基因时，基因内miRNA则通常位于外显子区域内。绝大多数miRNA是由RNA Pol II转录产生，会保留部分mRNA的特点，比如说5’端帽子结构及3’端poly A尾巴。但是，也有一部分miRNA是由RNA Pol III转录产生的。

miRNA的分布 图片来源：Garzon R, Calin G A, Croce C M. MicroRNAs in cancer[J]. Annual review of medicine, 2009, 60: 167-179.

miRNA的生物学功能

通常情况下，RNA Pol II首先从miRNA基因簇转录产生一个发夹结构的转录本，称作pri-miRNA。pri-miRNA由一个包含了Pasha和Drosha 的RNA内切酶的复合体剪切成为pre-miRNA，此后pre-miRNA会被转运出核，进入胞质，由另一个RNA内切酶Dicer切割成为成熟miRNA，这个步骤也通常伴随着RISC的绑定。miRISC由miRNA引导，识别一段位于靶点mRNA3’UTR区域、与miRNA互补的特异序列，与该靶点mRNA结合，造成mRNA降解，或抑制mRNA翻译，这段互补序列也被称作miRNA的种子序列（seed sequence）。从目前已有的实验及计算机预测结果来看，一个miRNA可能抑制超过100种mRNA，人体中有超过60%的蛋白编码基因的mRNA 3’UTR区域包含有miRNA结合位点，足以证明miRNA在动物体内基因调控过程中的重要性。

除此之外，近些年来，也有研究发现miRNA其他功能，2014年5月，Science子刊Science Signal报道了两篇论文。这两篇论文探讨了let-7这个miRNA被分泌到胞外，做为Toll样受体7（Toll like receptor, TLR7）的配体，在不同神经元中与TLR7互作，对神经元状态产生影响。这也是miRNA通过3’UTR区域的种子序列影响mRNA这个主要功能之外，另一个较为重要的功能。

miRNA合成过程  图片来源：Garzon R, Calin G A, Croce C M. MicroRNAs in cancer[J]. Annual review of medicine, 2009, 60: 167-179.

let-7b通过不同位置的TLR7产生不同神经反馈（A）在皮质神经元和海马神经元中，TLR7在核内体中，细胞吸收外泌体或包含有let-7b的凋亡小体，刺激核内体中的TLR7，进一步诱导MyD88，催化细胞凋亡。UNC93B1帮助将TLR7运输到核内体（B）在疼痛神经元中，let-7b通过与质膜上的TLR7互作，进一步刺激质膜上的TRPA1，产生疼痛反应。TRPA1可能诱导TLR7转运到质膜表面。图片来源：Winkler C W, Taylor K G, Peterson K E. Location Is Everything: let-7b microRNA and TLR7 Signaling Results in a Painful TRP[J]. Science signaling, 2014, 7(327): pe14.

近些年来，随着对miRNA研究的深入，越来越多疾病也被发现与miRNA失调有关，包括癌症、白血病等恶性疾病，miRNA也成为新药开发的重要备选靶点。研究者希望通过探索miRNA作用机制，了解疾病发生过程，开发新型治疗手段。

引起疾病的miRNA失调可能是由于多种原因，包括miRNA基因被删除、miRNA基因或其靶点出现点突变、miRNA转录单元的表观沉默以及miRNA合成过程出现缺陷。下表总结了部分近几年所发现的与miRNA有关的疾病。

miRNA	基因位置	失调状态	相关疾病
miR-15a	13q14	频繁删除	B细胞慢性淋巴细胞白血病、非小细胞肺癌、前列腺癌、垂体腺癌、卵巢癌
miR-16-1		下调
miR-17-19b基因簇	13q31-32	过表达、扩增、杂合性丢失	B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、肺癌、肝癌
let-7家族	多个位点	下调	肺癌
miR-143	5q32-33	下调	结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴瘤
miR-21	17q23.2	上调	恶性胶质瘤、乳腺癌、病毒性心肌炎
miR-155	21q21	上调	多种淋巴瘤
miR-142	17q22	Myc过表达	B细胞淋巴瘤
miR-10a	多个位点	体细胞突变	卵巢癌
miR-622
miR-767-5p
miR-888
miR-1280
miR-34b/miR-34c	11q23.1	表观沉默	结肠癌
miR-195	17p13.1	上调	心肌肥厚
miR-1	20q13.33	下调	心肌肥厚
miR-133	18q11.2		肌肉萎缩
miR-146b	10q24.32	上调	病毒性心肌炎
miR-21	17q23.1
miR-1	20q13.33	上调	病毒性心肌炎
miR-206	6p12.2	上调	肌肉萎缩症
miR-143	5q32	上调	肥胖
miR-17-92		过表达
miR-29a/b	7q32.3	下调	阿尔茨海默症
miR-107	10q23.31
miR-133	18q11.2		帕金森症

研究策略

经过多年的研究，目前对于miRNA研究已经有了一套成熟的策略，关于miRNA也已经有多个完备的数据库，且还在不断扩增。关于miRNA研究策略，可用下图概括：

差异筛选

高通量技术的发展，为疾病组织与正常组织之间的差异miRNA初步筛选提供了强有力的工具，目前，主要的筛选工具是高通量测序（Next Generation Sequencing，NGS）及生物芯片。

生物芯片通过参考已有的数据信息，针对每个miRNA转录本设计探针，通过探针和转录本反转录产生的cDNA之间的杂交，判断不同样本之间的转录本表达差异。生物芯片本质上是核酸杂交，整个芯片系统也是一个封闭的系统，不能检测探针没有覆盖到的区域；而近些年来逐渐发展起来的小RNA测序，是一个开放的系统，理论上讲，按照流程，不管有没有参考序列信息，都可以进行检测（de novo和re-sequencing）。所以，生物芯片不能发现新的miRNA，而小RNA则可以发现一些未知miRNA及其他小分子RNA。
不过，由于NGS本质上依然是PCR，在建库过程中会对样品进行成千上万倍的扩增，样品中miRNA的量可能会产生一些偏差，会对NGS定量效果产生一定影响，如果要对已知参考序列信息的物种进行miRNA表达量检测，生物芯片依然更有优势。

高通量技术不同于高数量技术，它的优势在于同时检测成千上万个基因或转录本，并非同时检测成千上万个样本。如果只是想检测有限的几个miRNA表达差异，大可不必选择高通量技术，通过一代测序及qPCR即可达到筛选目的。而对于生物芯片或NGS筛选出的表达差异，也需要通过qPCR、Northern Blot及miRNA-FISH等技术手段进行验证，以确保筛选准确度。

数据分析

目前，针对miRNA测序及芯片的数据分析内容，主要包括样品间miRNA表达差异分析、miRNA表达聚类分析、外显子/内含子注释等，高级分析包括miRNA靶基因预测、miRNA碱基编辑分析、miRNA调控网络构建等内容。研究者可根据自己的研究目的，自由定制分析内容，最高效率利用数据。

miRNA与基因相互作用，将其组织成一个整体便是调控网络(Regulatory Network)。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。

miRNA调控网络研究，离不开生物信息学和系统生物学。运用生物信息学的方法和技术通过数据采集、分析、建模、模拟和推断等手段研究复杂的miRNA调控网络关系，揭示有关的作用机理。

构建原理：1、分别分析若干个miRNAs下游调控的靶基因；2、多个miRNA的靶基因之间相互作用的关系分析；3、对miRNA上游调控调控因子进行分析，例如TF等；4、将上述数据进行整合，构建miRNA调控网络。

图例 miRNA调控网络构建原理

实例：

 
图例 miRNA与靶基因相互作用网络

如上图，黄色菱形为miRNA，浅蓝色圆点为靶基因，深蓝色线条是蛋白互作关系，红色线条是miRNA与基因的靶向关系。可见miRNA调控的基因数目有较大差异，这可能就揭示了该miRNA在调控网络中处于关键的位置。再通过蛋白互作网络元素权重分析，可从中预测重要的靶基因，为下一步功能验证奠定基础。

机制探索

初步筛选与生物信息分析完成后，需要对所预测的靶基因进行验证，同时探索miRNA出现差异的原因，这一部分研究主要包括功能获得（gain of function）和功能缺失（loss of function）研究。对于靶基因验证过程，主要借助qPCR及靶基因3’UTR荧光素酶载体，验证miRNA在靶基因3’UTR区域上的特异种子序列。在功能获得研究中，主要利用miRNA mimic/agomir，在细胞中特异性上调miRNA，进而改变靶基因丰度及其所在通路，结合其他技术来检测细胞表型及内部变化，以确认miRNA过表达对细胞的影响；而在进行功能缺失研究时，则主要利用miRNA inhibitor/antagomir，下调miRNA表达量或竞争性结合靶miRNA，再考察细胞变化。

miRNA lof（miRNA mimic）和gof（miRNA antagomir）研究示意图  图片来源：Ono K, Kuwabara Y, Han J. MicroRNAs and cardiovascular diseases[J]. FEBS Journal, 2011, 278(10): 1619-1633.

对于miRNA表达出现差异的机制研究，思路同mRNA差异分析类似，主要是从基因组蛋白表观修饰状态、DNA甲基化状态及重要转录因子结合模式等方面考察，所用到的实验手段包括ChIP-Seq、BS、荧光素酶重组子验证等。

完成miRNA功能及调控机制的研究后，可基本确认miRNA从哪里来，到哪里去，接下来需要结合研究目的，进行其他方向的功能研究，如miRNA对细胞凋亡、miRNA对癌细胞转移的影响等内容。最后，需要利用活体实验验证体外功能，一般选择小动物活体成像平台，利用专门设计的miRNA agomir/antagomir，靶向改变动物体内特定的miRNA表达量，观察动物体内变化，如肿瘤大小、癌细胞转移情况等。对于有条件的研究者，也需要在进行功能研究时辅以临床数据验证，可更有说服力地证明miRNA是否能够在未来成为一个新药开发的特殊靶点。

2013年，美国、德国3位科学家凭借他们所发现的细胞囊泡运输的调节机制，荣获2013年诺贝尔生理学或医学奖。外泌体(exosomes)作为人体内一类重要囊泡，也开始受到越来越多的关注。某些癌细胞会通过外泌体将一些特异miRNA输送到其他区域，影响正常细胞，随着研究深入，人们日益认识到，外泌体所包含的miRNA可能会成为诊断和治疗某些疾病的特殊标志物，所以，对外泌体miRNA成为新热点。我们将在后续专题详细讨论外泌体研究方案。

延伸阅读：

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