《相约2015NSFC》之外泌体RNA研究案例

【字体: 时间:2014年11月24日 来源:锐博生物

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案例一:外泌体miRNA如何影响细胞通讯

研究者选择骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMDM)和血管上皮细胞(endothelial cells, ECs)作为样本,希望了解miRNA从细胞分配进入外泌体的机制及外泌体miRNA对受体细胞的影响。利用qPCR检测,研究者发现,当细胞中miRNA表达量出现变化时,外泌体中相应miRNA也会出现相同变化趋势,但变化幅度会更大。若使用特殊结构慢病毒处理细胞,发现当细胞中包含miRNA的3’UTR结合位点的转录本表达上升时,miRNA的表达量会相应出现下调,而且外泌体中的变化幅度依然比细胞中大,研究者将这种现象称为“miRNA海绵效应”。为了验证这种效应,研究者通过RNA-Seq检测了IL-4处理后的BMDM,结果发现有7000多个转录本出现表达差异,通过计算模型分析,研究者证明,这个miRNA海绵效应,实际上是细胞在受到刺激时,某些转录本转录状态会出现变化,从而影响一些靶序列位于这些转录本上的miRNA,并分配他们进入外泌体中,但细胞内的miRNA水平则不会受到影响。

而为了研究外泌体运输所介导的细胞通讯,研究者使用慢病毒构建出一种荧光标记的BMDM外泌体,并用此外泌体处理血管上皮细胞(endothelial cells, ECs),qPCR检测则发现,某些从BMDMs富集到外泌体中的miRNA,在ECs中也出现明显上调;利用流式细胞仪检测发现,外泌体被ECs吞下,且最终可能在溶酶体中被分解,但研究者通过构建特殊慢病毒的手段,保证外泌体中的miRNA能够保留其基因调控功能。经过RNA-Seq分析,也证明ECs中miRNA的靶基因确实受到了miRNA的调控。这些数据表明,巨噬细胞确实会利用外泌体运输miRNA,通过内吞作用进入其他细胞并发挥调控作用,以起到远程调控的功能。
 
随着研究的不断深入,人们日益认识到,外泌体所包含的miRNA可能会成为诊断和治疗某些疾病的特殊标志物,而本研究的意义在于,它不仅鉴定出了miRNA由细胞分选进入外泌体的通用机制,也阐述了外泌体进入受体细胞后其中所包含的miRNA的功能及命运,是对现有外泌体miRNA研究的重要推动。

相关文献:Squadrito M L, Baer C, Burdet F, et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells[J]. Cell reports, 2014, 8(5): 1432-1446.

案例二:外泌体miRNA促乳腺癌转移

之前研究已发现,癌细胞所分泌的外泌体中的miRNA,可以由其他细胞吸收,这些细胞可以存在于原发性肿瘤微环境中,也可以存在于转移前或转移中微环境中。本项研究中,研究者选择有转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231(MBC)及正常人上皮细胞MCF-10A所分泌的外泌体作为研究模型。对两类外泌体进行RNA-Seq,发现miR-105在MBC外泌体中特异性富集;将两种外泌体同人微血管上皮细胞(HMVEC)孵育后,发现HMVEC迁移受到MBC外泌体刺激,通过检测两种外泌体处理后HMVEC中miR-105水平,结合RNA聚合酶II抑制剂处理及miRNA标记实验,证明HMVEC胞内成熟miR-105水平会呈现与外泌体摄取过程一致的上升趋势。

通过软件预测,结合报告载体验证,证明紧密连接蛋白ZO-1基因是miR-105的靶基因,而MBC外泌体及其他miR-105高表达外泌体和细胞也确实会引起HMVEC中ZO-1的mRNA和蛋白下调,同时改变HMVEC单分子层渗透性,损坏HMVEC所产生的血管结构,且提高癌细胞跨内皮侵润能力,总结以上实验,证明MBC外泌体所包含的miR-105在体外环境可以促进HMVEC迁移,破坏HMVEC所形成的内皮障碍。

在接下来的体内实验中,研究者将miR-105表达量不同的几种外泌体分别注入小鼠体内,发现miR-105高表达的外泌体会显著提升肺部、脑部细胞miR-105表达量,同时伴随ZO-1下调,血管通透性提高。对小鼠进行外泌体预处理,并在心脏注射标记的MBC细胞,数个星期后检测荧光素基因,MBC外泌体处理也显著提升了MBC向肺部与脑部的迁移作用。

为了判断原发肿瘤中miR-105水平是否影响BC迁移,研究者构建了一个可以稳定过表达miR-105的致瘤细胞株MCFDCIS,移植到小鼠体内,数周后小鼠的肺部与脑部出现了癌细胞远距离迁移,血管通透性提高,MCFDCIS对周围组织产生广泛扩散。同时,在小鼠体内原发肿瘤及远距离转移和未转移区域内都发现了miR-105,CD31+血管内皮细胞中ZO-1下调,而使用抗miR-105复合物则可以有效修复血管通透性,恢复ZO-1表达。这些结果说明,肿瘤细胞通过表达并分泌高水平miR-105,增强肿瘤细胞侵润能力,减弱宿主内皮屏障,在体内环境中获得更强迁移能力。

在动物实验完成后,研究者希望进一步了解临床样本中miR-105在BC转移中的角色。通过比对38个BC II和BC III期病人血清miRNA水平,将病人肿瘤样本和血清同未转移病人及健康组织比较后,发现循环外泌体和肿瘤miR-105水平的正相关关系。相反,肿瘤miR-105和ZO-1、循环外泌体miR-105和肿瘤邻近血管ZO-1表达之间为负相关,病人血清会破坏血管组织。

本文研究者通过体外实验、动物实验及临床分析,充分验证了BC所分泌的外泌体中的miR-105与BC迁移的关系,最终证明miR-105可通过抑制ZO-1实现促转移作用。但是本文并没有阐明miR-105的调控机制,这或许是研究者下一步工作重点。

HMVEC与不同外泌体孵育后结果

HMVEC中,ZO-1是miR-105靶点,MBC外泌体孵育后,ZO-1蛋白及mRNA下调

标记的外泌体通过尾静脉注射进入小鼠体内(一周两次),五次注射后,小鼠肺部和脑部出现标记的外泌体

MBC植入小鼠后,进行不同处理,检测荧光,确定miR-105对血管通透性的影响。

相关文献:Zhou W, Fong M Y, Min Y, et al. Cancer-Secreted miR-105 Destroys Vascular Endothelial Barriers to Promote Metastasis[J]. Cancer cell, 2014, 25(4): 501-515.

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案例三:外泌体揭开心脏修复秘密

研究者将一种特定的心脏干细胞: Cardiosphere分化细胞注射进入小鼠心脏,发现这种干细胞可以促进修复心脏病所造成的损伤,比如促进心肌增殖,减少瘢痕等。但是干细胞在注射后几个月便会消失,它所产生的修复效应却能持续至少一年。研究者怀疑干细胞并不需要一直存在才能产生效应,或许还存在其他间接机制。接下来,他们在小鼠心脏病模型中屏蔽掉干细胞分泌外泌体的能力后,心脏修复也随之消失,单独注射外泌体又能恢复修复能力。结合其他研究结果,证实外泌体才应该是心脏再生相关通路中最关键角色,并非之前认为的心脏干细胞。

                   

未注射外泌体            注射其他外泌体            注射Cardiosphere外泌体促心肌增殖

研究者进一步对所注射的心脏干细胞中的miRNA进行了检测,发现miR-146a比普通成纤维细胞外泌体中上调了将近250倍,不过单独控制miR-146a并不会促进心脏功能再生,它只作用少数几个基因,而不是整个通路。从目前的数据来看,miR-146a是通过特殊通路,介导了心肌梗塞后心脏细胞炎症效应的发生,虽然心脏病后的炎症加剧是有害的,但适当的炎症效应对于清除死细胞的修复过程又是必需的。另外,已有研究结果已发现miR-146a会损伤小鼠心脏的功能,比如患上围产期心肌病的女性体内miR-146a会上调,所以miR-146a所产生的效应取决于感受细胞中它能接触到的调控靶点,确定心脏病模型中miR-146a靶基因及miR-146a所参与的通路将非常重要。

目前,Cardiosphere分化细胞还未进行人体实验,但研究者十分看好这种干细胞所分泌的外泌体的修复能力,由于外泌体在体外很稳定,而且没有完整细胞那么复杂,非常适合开发新的临床疗法。但miR-146a靶基因很多,必须保证这些外泌体中的miRNA不会作用于有害靶基因而产生预期之外的不良效果,这也将是新疗法未来研究重点。

相关文献:Ibrahim A G E, Cheng K, Marbán E. Exosomes as Critical Agents of Cardiac Regeneration Triggered by Cell Therapy[J]. Stem Cell Reports, 2014, 2(5): 606-619.

案例四:外泌体miRNA作为配体影响信号通路

来自德国柏林夏里特大学的研究者在近期研究中发现,一种let-7家族的miRNA:let-7b会进入皮层神经元中,利用一个多GU序列,结合并激活细胞核内体中的TLR7,促使TLR7富集接头蛋白MyD88,产生细胞凋亡反应,引起神经退行性病变。这个过程可以概括为let-7b/TLR7/MyD88通路。在此通路中,let-7b可能来自其他濒死神经元分泌的外泌体,也有可能来自细胞自身分泌外泌体。let-7b的这种功能,可能会引起神经性变相关疾病发生,如阿尔茨海默病等。

然而,美国杜克大学研究者却得到了与德国同行不同的研究结果。他们发现,在与疼痛感知相关的背根神经节(DRG,痛觉传入的第一级神经元,在痛觉的外周机制中起重要作用)神经元受到伤害性刺激时,细胞会上调并释放let-7b,与细胞膜上的TLR7互作,激活一个阳离子通道瞬时感应器A1(TRPA1),通过细胞表面电位变化,产生疼痛过程,这个过程不需要髓鞘,而且是缓慢发生的。

两所大学的研究者在对神经元中miRNA进行研究时,发现了不同的功能。在皮层神经元,let-7b这个miRNA会诱发细胞凋亡,引起神经退行性疾病;但在DRG神经元中,let-7b却又会刺激TLR7受体,提高神经元细胞敏感度。

对于这种功能差异,第一类解释认为,是不同神经细胞中TLR7定位不同造成了let-7b的功能差异。在皮质神经元中,转运蛋白UNC93B1会特异性地将TLR7从内质网经高尔基体运送到核内体中,但在DRG神经元中,TLR7并不会被运送到核内体,而是通过其他途径,定位到质膜上。不同位置的两种TLR7与let-7b互作,产生信号。除了转运蛋白,转运过程中其他因素也可以影响TLR7定位,如pH、辅助因子等。而第二类解释则认为,是不同的配基,让不同神经元中的let-7-TLR7互作产生了不同信号。在皮质神经元中,let-7b利用一个富含GU的序列与TLR7结合,而这个序列如果稍作改变,还可以结合其他RNA,产生不同信号,在其他let-7家族成员刺激TLR-7时就能发现这种现象。所以,这种解释认为,是不同的配体,让let-7-TLR7互作产生了不同的信号。

以上这些研究内容,可以说颠覆了miRNA的传统作用模式,miRNA不再以miRISC的形式参与mRNA转录后调控,而是通过外泌体释放,与细胞表面受体直接互作,产生信号。一方面,以let-7b为代表的let-7家族miRNA会通过外泌体进入皮层神经元细胞,激活核内体中的TLR7,促使细胞凋亡发生,诱发阿尔茨海默及其他神经变性相关疾病;另一方面,在疼痛DRG神经元中,let-7b又可以与细胞膜上的TLR7互作,进一步激活TRPA1,改变细胞膜电位,产生疼痛反馈,提高神经元细胞灵敏度。这些研究,扩宽了miRNA和TLR7在神经反应过程中的调控作用,并证明TLR7在胞内的不同定位可能促成了神经元之间功能差异。确定TLR7在不同神经元中的定位、转运过程以及各个信号通路中的信号分子,可以更好地理解miRNA是如何调控中枢神经系统(CNS)的健康和疾病状态。同时,通过了解miRNA的来源,可以针对miRNA进行靶向作用,影响miRNA功能,也可以直接利用外泌体miRNA与不同受体结合,产生响应信号,这可能成为治疗神经疾病的新思路。

目前,miRNA研究已经获得了不少成果,但依然有很多未知功能没有被发现。本文中所提到的神经元中miRNA功能探究,可以为其他miRNA研究者提供很好的借鉴作用,人们或许通过对外泌体miRNA和细胞中miRNA直接受体进行研究,得到更多有用信息,改善一些疾病治疗手段。

不同神经元中let-7b-TLR7互作通路(A)在皮层神经元中,UNC93B1蛋白将TLR7由内质网经高尔基体定位到核内体中,神经元吸收含有let-7b的外泌体后,let-7b与核内体中的TLR7互作,进一步富集MyD88蛋白,促使神经元凋亡(B)DRG神经元中,TLR7经其他通路定位到细胞膜上,神经元在受到伤害性刺激时,上调并分泌let-7b,let-7b与细胞膜上TLR7互作,影响TRPA1,产生细胞膜电位变化,引起疼痛反应。

相关文献:S. M. Lehmann, C. Krüger, B. Park, K. Derkow, K. Rosenberger, J. Baumgart, T. Trimbuch, G. Eom, M. Hinz, D. Kaul, P. Habbel, R. Kälin, E. Franzoni, A. Rybak, D. Nguyen, R. Veh, O. Ninnemann, O. Peters, R. Nitsch, F. L. Heppner, D. Golenbock, E. Schott, H. L. Ploegh, F. G. Wulczyn, S. Lehnardt, An unconventional role for miRNA: let-7 activates Toll-like receptor 7 and causes neurodegeneration. Nat. Neurosci. 15, 827–835 (2012).

C. K. Park, Z. Z. Xu, T. Berta, Q. Han, G. Chen, X. J. Liu, R. R. Ji, Extracellular microRNAs activate nociceptor neurons to elicit pain via TLR7 and TRPA1. Neuron 82, 47–54 (2014).

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