中科院等《Cell Research》解析AMPK调控结构基础

2014年11月21日，中科院广州生物医药与健康研究院、中国科技大学、美国安德尔研究所、新加坡国立大学和中科院上海药物所的研究人员在国际著名学术期刊《Cell Research》发表了一项最新研究成果，题为“Structural basis of AMPK regulation by adenine nucleotides and glycogen”。这项研究揭示了腺嘌呤核苷酸和糖原调控的AMPK的结构基础。

　　

生物通报道：2014年11月21日，中科院广州生物医药与健康研究院、中国科技大学、美国安德尔研究所、新加坡国立大学和中科院上海药物所的研究人员在国际著名学术期刊《Cell Research》发表了一项最新研究成果，题为“Structural basis of AMPK regulation by adenine nucleotides and glycogen”， 中科院广州生物医药与健康研究院的吴东海博士、王东业博士，中科院上海药物研究所的徐华强博士都是这篇论文的共同作者。这项研究揭示了腺嘌呤核苷酸和糖原调控的AMPK的结构基础。

AMPK是一种进化上保守的、异源三聚体的丝氨酸/算是蛋白激酶。它的激酶活性是由能量应力激活的，例如ATP和AMP/ADP比值下降，从而允许AMPK通过磷酸化大量的细胞靶标，上调ATP产生途径和抑制能量消耗程序。由于其在葡萄糖摄取和代谢以及生长和增殖过程中的重要作用，AMPK是糖尿病、肥胖和癌症治疗一个有前途的靶标。

AMPK包含一个α-亚基——其具有一个N末端的激酶结构域（KD）和一个调控的C末端，一个糖原结合β亚基和一个AMP/ADP/ATP结合γ亚基。α亚基的调控C末端，包含一个自抑制结构域（AID），夹在KD和传感器（αRIM）环之间，一个β亚基相互作用域（β-ID），和一个丝氨酸/苏氨酸丰富的环（ST环），它通过PI3K/Akt和糖原合成酶激酶3介导磷酸化作用和信号转导。

AMPK活性，通过其上游激酶的激酶活化环磷酸化而大大增强，包括LKB1和CaMKKβ。AMP与γ-亚基结合，通过刺激LKB1和AMPK与支架蛋白axin的物理相互作用，以及减少磷酸酶可以得到的激活环，而增加净激活环磷酸化，后者依赖于β-亚基碳水化合物结合模块（CBM）的存在。

此外，AMP结合也直接激活AMPK激酶活性。ADP似乎可轻微地对抗活化环的去磷酸化，对激酶的直接激活没有影响，一直被认为可通过上游激酶影响磷酸化，尽管后者最近产生了争议。相反，ATP被认为能够通过与AMP竞争结合调控γ-亚基，而抵消AMP的刺激作用。γ-亚基包含四个胱硫醚β-合成酶（CBS）型腺嘌呤核苷酸结合基序，其中CBS-1、CBS-3和CBS-4可以竞争性的结合AMP、ADP或ATP。相反，CBS-2则不能结合核苷酸，因此它是空闲的。

关于AMP如何调节AMPK活性的重要见解，来自于结合两个AMP分子（在CBS-3和CBS-4位点）、几乎全长的哺乳动物AMPK复合物的晶体结构。这个结构确定了来自α亚基的一个环，原名α钩，最近重新命名为αRIM，它可直接在CBS-3上结合AMP，表明这种环功能为腺嘌呤核苷酸传感器。除了CBS-3/AMP与αRIM环的αRIM-2段结合之外，环的N末端向后折叠并连接到AID。在AMP结合结构中，AID的C末端和αRIM环的N末端，形成一种相互作用的表面，称为αRIM-1，它结合到γ-亚基空闲的CBS-2位点。相反，在一个无效的裂殖酵母KD-AID片段结构中，AID结合KD的铰链区，将KD锚定在一个无效的开放的构象。

虽然裂殖酵母AMPK缺乏αRIM传感器环，并具有相对较弱保守的AID，但突变数据与组合结构表明，AMP通过诱导αRIM-2结合AMP占用的CBS-3，直接激活激酶活性。反过来这又被认为能够稳定AID-αRIM 和γ-亚基的相互作用，从而使AID脱离与KD的抑制相互作用。

除了腺嘌呤核苷酸，糖原和非生理性糖原模拟环糊精，也可以调节AMPK。虽然Polekhina et al.没有检测到糖原对纯大鼠肝AMPK活性的影响，McBride et al.报道称，糖原和肝糖原模拟环糊精可温和地抑制重组体（E. coli表达AMPK）的催化活性，更大大抑制了免疫沉淀的自然大鼠肝AMPK的活性。无论AMP存在或缺乏，报道的糖原调控都会发生，并依赖于AMP与CBM碳水化合物结合环的结合。最后，通过一种不同于已知生理调节的机制，AMPK也可以被结合碳水化合物结合环外CBM的药理化合物而激活。

AMPK结合化合物991和A769662的最近结构表明，它们可与CBM和KD结合，介导CBM-KD相互作用，并且它们可能通过诱导α螺旋（称为C相互作用的螺旋）的形成，使KD稳定在一种活性的构象。此外，A769662可以与AMP协同作用，以一种CBM依赖性的方式，完全激活AMPK，即使缺乏上游激酶磷酸化的情况下。

为了确定AMPK被其生理学别构调节物调控的分子和结构基础，这项研究解决了结合AMP的非磷酸化和活跃磷酸化holo-AMPK、糖原模拟环糊精的晶体结构，以及不活跃的人AMPK KD-AID复合物的结构。

结合生化和突变数据，这项研究所揭示的结构，重新捕捉到了AMP和ATP调控的AMPK的一个机械模型，其中AMP结合CBS-3可诱导AID-αRIM和γ-亚基的相互作用，并通过减少激酶结构域的AID抑制，导致AMPK激活。通过竞争性结合γ-亚基以及破坏AID-αRIM和 γ-亚基之间的相互作用（不依赖于腺嘌呤核苷酸与CBS-3的结合），ATP可抵消AMP的作用。

此外，这些结构揭示了糖原的一种变构机制，糖原与CBM的结合，可破坏CBM-KD的相互作用。总之，这些结果对于我们理解腺嘌呤核苷酸和碳水化合物调节的AMPK，提供了一个综合框架。

（生物通：王英）

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生物通推荐原文摘要：
Structural basis of AMPK regulation by adenine nucleotides and glycogen
Abstract: AMP-activated protein kinase (AMPK) is a central cellular energy sensor and regulator of energy homeostasis, and a promising drug target for the treatment of diabetes, obesity, and cancer. Here we present low-resolution crystal structures of the human α1β2γ1 holo-AMPK complex bound to its allosteric modulators AMP and the glycogen-mimic cyclodextrin, both in the phosphorylated (4.05 Å) and non-phosphorylated (4.60 Å) state. In addition, we have solved a 2.95 Å structure of the human kinase domain (KD) bound to the adjacent autoinhibitory domain (AID) and have performed extensive biochemical and mutational studies. Together, these studies illustrate an underlying mechanism of allosteric AMPK modulation by AMP and glycogen, whose binding changes the equilibria between alternate AID (AMP) and carbohydrate-binding module (glycogen) interactions.