miRNA表达谱分析 样品不够怎么办？[创新技巧]

microRNA（miRNA）是小的非编码RNA，长度约为22个核苷酸。它们广泛存在于动物和植物中，调控了正常和病理过程中数千个基因的表达，而它们的异常表达与多种类型的癌症及其他疾病相关联。

许多研究表明，miRNA有望在各个医学和兽医应用中成为生物标志物，包括诊断、预后及以核酸为基础的治疗。研究人员可以监控组织、细胞和体液（如尿液、脑脊液、血液）样品中miRNA的水平。

对于miRNA表达谱分析，最准确而特异的方法是实时定量PCR（qPCR）。这种技术只需要少量的样品，具有宽的动态范围，能够在单次分析中准确定量10至10⁷个拷贝的miRNA目标。利用qPCR，我们只需要1.5 µg总RNA，即可开展miRNA组（miRNome）分析。

然而，RNA有时很难得到，但我们还是希望能分析多个miRNA甚至miRNome，怎么办？在此，我们提供了一些技巧，帮助您克服样品量的限制，同时还为您奉上处理不同类型样品的注意事项。

预扩增

microRNA表达谱分析涉及到RNA纯化、cDNA合成和qPCR。若是插入一步预扩增，仅含10 ng总RNA的样品也能开展miRNome分析。预扩增试剂盒，如QIAGEN的miScript™ PreAMP PCR Kit和引物混合物通过PCR来无偏向地扩增cDNA，产生足够表达谱分析所用的材料。在血液、尿液及其他体液的实验中融入预扩增，可将cDNA的浓度提高1000倍或以上，让研究人员能够最大限度地利用他们宝贵的样品。

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效率和对照

在分析过程的每一步，对照都很重要。miRNA分离的对照可帮助您监控从每个样品中分离RNA的重复性和数量。其他监控逆转录和qPCR步骤的对照也能增加数据的有效性，为qPCR的酶促步骤是否达到最佳状态提供证据。

RNA纯化和逆转录的对照通常是单链的非灵长类RNA（如QIAGEN的线虫miRNA，cel-miR-39-3p），它可在RNA纯化前加标到样品中，而逆转录对照是另一种单链合成RNA，在分离后、逆转录前添加到RNA样品中。PCR对照通常是人工合成的DNA，可用来监控污染和抑制剂。在分析过程中串联使用这三个对照，研究人员就能轻松排除无效的数据。

在利用ΔΔCT方法进行相对定量时，样品标准化对照也是特别重要的。与疾病相关的miRNA变化水平不太大，这意味着必须精确测定样品量的微小差异。细胞样品的标准化对照通常是非编码RNA，如snRNA和snoRNA，但在分析循环miRNA时，必须使用其他方法。

特别提醒

血液样品

目前主要有三种类型的血液样品：全血、有核细胞部分和细胞外部分（血清或血浆）。让人惊讶的是，miRNA稳定存在于细胞外液中，包含在exosome及其他小囊泡内。与血清相比，从EDTA或柠檬酸盐抗凝的全血中分离出的血浆是更好的选择。避免使用含有肝素的样品，因为那是一种强力的逆转录酶抑制剂，在纯化过程中无法去除。

全血和有核细胞部分通常含有足够的miRNA，没必要预扩增。不过，假如采用预扩增的策略，即使1 µL全血也足够miRNA分析。

血浆和血清样品广泛用于循环miRNA的研究，它们可作为非侵入性的生物标志物。通常20 µL样品足够qPCR分析使用，但预扩增可使检测到的miRNA明显增加，特别是当miRNA以低丰度存在时。1 µL血浆经过预扩增，可开展完整的miRNome表达谱分析。

在miRNA表达分析中，小的非编码RNA（如snRNA和snoRNA）常用于数据的标准化。然而，这些RNA在血清和血浆中不表达，因此我们要采取替代方法。其中包括：(1) 采用外部RNA（如QIAGEN的线虫cel-miR-39）作为加标对照；(2) 所有表达miRNA的平均循环阈值（Ct）；(3) 所比较样品共有的普遍表达miRNA的平均Ct。

尿液样品

对于肾脏和前列腺疾病而言，尿液样品中也有望发现生物标志物。从200 μl尿液回收的miRNA通常不够一块96或384重PCR芯片的分析。更大样本的处理会提高RNA产量，但也会增加样本中存在的抑制剂。对于尿液中无细胞miRNA的分析，最好是先通过离心或过滤来去除细胞和细胞碎片。之后处理100-200 μl尿液，进行RNA分离和cDNA合成，并在qPCR反应之前开展预扩增。对于细胞miRNA的分析，应离心样品，并从细胞和碎片的沉淀中纯化RNA。

长期保存的FFPE样品

FFPE样品通常包含了丰富的信息，这让它们成为发现生物标志物的理想之选。与较长的mRNA不同，miRNA一般不会受到交联步骤的影响。利用预扩增，5 μm的FFPE切片也能产生足够的RNA，用于miRNome分析。由于固定和保存的变化，一定要重视逆转录的对照，我们可以采用与miRNA同时分离的RNA，如其他不变的miRNA、snoRNA或其他非编码小RNA。

其他少量的细胞样品

对于分选的细胞、细针穿刺、显微切割及其他限制样品，开展总RNA纯化，并融入预扩增。一些miRNA分离试剂盒，如QIAGEN的miRNeasy Micro Kit，就是专门为从少量样品中分离高质量RNA而开发的。

每个样品都是独特的，有其自身的挑战。在最近几年，在实时定量PCR分析之前融入预扩增策略，让研究人员能够从最少量的样品中榨出最大量的数据。（生物通 薄荷）